[发明专利]一种以羟甲基戊二酰辅酶A还原酶为靶点的胆固醇代谢调控药物筛选系统及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及细胞靶标筛选化合物系统，更具体的，本 发明涉及建立羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)细胞靶标快速筛选调节 胆固醇药物的系统和方法。

背景技术

胆固醇不仅是生物膜的关键组成成分，还是胆汁酸、甾醇类激素等合成的 前体。然而，体内高水平胆固醇如高胆固醇血症可直接导致动脉粥样硬化，是 中风和冠心病的主因；老年痴呆症、肥胖症、糖尿病等的发生也与胆固醇代谢 紊乱密切相关。由于高胆固醇的致病性，在心血管等疾病的治疗与预防方案中 都把降胆固醇作为重要组成。

细胞内胆固醇的起始性合成是胆固醇代谢的重要组成，人体每天更新的约 1克胆固醇中，有2/3为自身合成获得。HMGCR是胆固醇合成过程中的限速酶， 它催化羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原为甲羟戊酸。

HMGCR所催化的HMG-CoA还原为甲羟戊酸是内源性胆固醇合成途径中 的关键步骤，目前临床应用最广泛的降胆固醇药物-他汀(Statin)类药物，就是 HMGCR酶活性的竞争性抑制剂，它针对HMGCR的COOH端结构域，竞争性 抑制甲羟戊酸的形成，从而降低胆固醇合成，刺激低密度脂蛋白(LDL)受体表 达，增强对血浆LDL的清除，从而达到降低血液胆固醇的目的。然而，服用他 汀类药物将使HMGCR蛋白量代偿性非常显著增多，导致患者不得不提高药物 剂量来抑制细胞内增多的HMGCR。这就使得该类药物在降胆固醇方面的作用， 表现为“用量上升、药效递减”，长期服用最后可形成严重不良的药物剂量增高 依赖性。而且已有报道，服用高剂量他汀类药物会引起肌肉毒性，严重者可发 生横纹肌溶解症。

从众多未知的化合物中筛选新的有效降胆固醇药物已成为心脑血管疾病 药物研发任务的重中之重。同时，寻找一种快速有效的化合物筛选系统也变得 尤为迫切。但是，传统的方法筛选化合物普遍存在着诸如周期长，操作繁琐， 特异性和敏感性差，不规范，不适用于大批量检测等明显的不足。

因此，本领域迫切需要开发一种方便快速、操作简单且具有良好的特异性 和敏感性的筛选胆固醇药物的系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方便快速、操作简单且具有良好的特异性和敏 感性的筛选胆固醇药物的系统及其构建方法。

在本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括：

(a)羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域；

(b)可检测信号元件；和

(c)任选的位于(a)和(b)之间的连接元件。

在另一优选例中，所述的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域具 有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其同源性超过70％(优选的是同源性超 过80％；更优选的是同源性超过90％；进一步优选的是同源性超过95％)的氨 基酸序列。

在另一优选例中，所述的可检测信号元件选自(但不限于)：荧光蛋白、 荧光素酶、半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、抗体可识别的短肽。

在另一优选例中，所述的抗体可识别的短肽选自(但不限于)：Flag、T7、 Myc、HA。

在另一优选例中，所述的荧光蛋白选自：绿色荧光蛋白或增效的绿色荧光 蛋白。

在另一优选例中，所述的连接元件具有1-10个氨基酸。

在另一优选例中，所述的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域位 于氨基端，而所述的可检测信号元件位于羧基端。

在另一优选例中，所述的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的八次跨膜结构域位 于羧基端，而所述的可检测信号元件位于氨基端。

在本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述融合 蛋白；或与所述的核酸分子相互补。

在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自：质粒、病毒、或人工染色体。

在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述 的载体；或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。

在本发明的第五方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于筛选调节胆固醇 的物质。

在另一优选例中，所述的调节胆固醇是降低胆固醇或提高胆固醇。

在本发明的第六方面，提供一种筛选以羟甲基戊二酰辅酶A还原酶为靶点 的调节胆固醇的潜在物质的方法，所述方法包括步骤：