[发明专利]组织工程化静脉瓣及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物组织工程技术领域，是组织工程化静脉瓣及其制备方法。

背景技术

原发性瓣膜功能不全、血栓形成完全再通后的瓣膜破坏以及先天性瓣膜缺乏等静脉疾患，静脉瓣移植常常是最后的选择。但是，自体静脉瓣移植除来源有限、损伤较大外，尚有瓣膜强度不足和带瓣静脉的管径往往难以符合要求等问题。近年来，心血管组织工程技术的发展为构建组织工程化静脉瓣膜提供了可能。研究证明，虽然每条深静脉的瓣膜有多对，但只要移植一对有功能的瓣膜就能明显改善血液逆流的问题，这就使得构建组织工程化静脉瓣更具有实用价值。目前组织工程化静脉瓣的研究国外尚处于起步阶段，国内还无人涉及，还有诸如细胞、支架的选择、细胞种植与黏附、体内过程等许多不明确、亟待解决的问题，因此，开展组织工程化静脉瓣构建的深入研究具有重要的理论和实际意义。

理想的组织工程化静脉瓣应该具有类似天然瓣膜的三层结构，有较强的力学性能，能够承受跨壁压力和血流对瓣膜的切应力；表面应该完全内皮化，有较好的抗血栓形成、抗血小板黏附的作用；无免疫原性；具有生长和修复功能等特点。构建组织工程化静脉瓣的关键问题是瓣膜支架的制备、种子细胞的选取以及细胞能否成功种植到支架上的制备方法。

Pavcnik等采用金属架支撑的去细胞异体小肠黏膜下层(SIS)作为静脉瓣膜移植物经皮送至绵羊颈外静脉，由于没有种植细胞和进行再内皮化，移植物出现了出血、血栓、钙化等严重并发症。天然瓣膜支架去除了细胞和可溶蛋白成分，保留了胶原蛋白和弹力蛋白等重要的支架成分，从而既消除了免疫原性，又具有三维空间结构和机械性能，而且与细胞具有良好的生物相容性，利于细胞黏附、嵌入生长，增加细胞覆盖面积，可适应血管腔内高压力、高流量等复杂多变的环境，是较为理想的瓣膜组织支架。可见，未种植细胞的瓣膜支架材料体内种植不是瓣膜移植的理想选择。

静脉瓣的细胞成分除表面的内皮细胞外，间质内主要有平滑肌细胞、成纤维细胞和肌纤维母细胞等。Teebken等应用组织工程学原理，采用同种异体去细胞绵羊带瓣静脉作为支架，利用生物反应器在其上种植受体绵羊静脉壁来源的肌纤维母细胞和内皮细胞构建组织工程化静脉瓣(Teebken OE，et al.Tissue-engineered bioprosthetic venous valve：a long-term study in sheep.Eur J Vasc Endovasc Surg，2003，25：305-312)，但是肌纤维母细胞没能长入支架内部，移植到受体绵羊颈外静脉后，虽然短期内多数移植瓣膜有功能，但12周时半数组织工程化静脉瓣失去功能，这可能与种植细胞的活性、寿命及制备方法相关。Teebken等，将绵羊去细胞静脉瓣支架放入生物反应器中，静脉瓣支架和反应器之间形成两个空间，将肌纤维母细胞悬液加入外腔，将内皮细胞注射到内腔中；结果肌纤维母细胞没能长入静脉壁和瓣膜内。Abilez等报道研发出新型三维培养系统，并用来培养小鼠的ES，发现细胞可以长入聚合物支架内。Buttafoco等发现动态培养的平滑肌细胞也可以长入聚合物支架。但是不同细胞所需的环境和参数并不相同，目前还没有一种生物反应器能够完全模拟生理环境，也未见细胞生长入天然去细胞瓣膜支架的报道。胚胎干细胞(ES)可以避免以上问题，但免疫原性及伦理等问题限制了其大规模的应用。选择适宜的种子细胞，是构建组织工程化静脉瓣必须解决的首要问题。

成体多能祖细胞(MAPC)是近几年从成年个体多种组织中分离出来的接近胚胎干细胞的成体祖细胞(Jiang Y，et al.Multipotentprogenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow，muscle，and brain.Exp Hematol，2002，30：896)，MAPC具有的高活性和多分化优势，可以向三个胚层的细胞分化，类似全能性细胞。骨髓取材方便，祖细胞含量丰富，细胞分离培养相对简单，但未见选用骨髓来源的MAPC作为静脉瓣间质细胞的种子细胞的报道。