[发明专利]一种含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株及其用于制备菊粉外切酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程和发酵工程领域，具体涉及含有菊粉酶基因的鹰嘴豆克 鲁维酵母基因工程菌株，以及用该基因工程菌株制备菊粉外切酶的方法。

背景技术

菊粉(Inulinase)(Edelman，J.and T.G.Jefford.1964.The metabolism of fructose polymers in plants.4.Beta-fructofuranosidases of tubers of Helianthus tuberosus L.Biochem.J 93：148-161)，又称菊糖，分布在菊科、 龙胆科、桔梗科等植物中，特别是菊芋的块茎中含量丰富。菊粉是由6-60个呋喃 构形的D-果糖经β-2，1-糖苷键脱水聚合，两端再各连接一个分子葡萄糖而形成 的多聚物。菊粉外切酶(2，1-β-D-fructan fructanohydrolase EC3.2.1.7)能 水解β-2，1-D-果聚糖果糖糖苷键，将菊粉水解成单糖。

菊粉酶在以下方面有重要的应用前景。第一方面，是高果糖浆的制备。高果 糖浆是理想的天然甜味剂，果糖的甜度比蔗糖高出80％；它在肝脏中磷酸化后能 直接进入三羧酸循环，不像葡萄糖那样受到胰岛素的控制，也能适合糖尿病人食 用，有望成为替代蔗糖的新一代甜味剂。同时还具有营养保健功能，能调节肠胃、 提高免疫力、排毒养颜、降解血糖和抗癌等等，被称为第三代功能食品。传统的 高果糖浆的制备是以淀粉为原料，在淀粉酶的作用下水解成葡萄糖，再在异构酶 的作用下将葡萄糖异构成果糖，这种方式生产的高果糖浆中果糖的含量不足50％， 并且果糖和葡萄糖分离难，成本高；新型的生物酶法生产高果糖浆，是以菊粉为 原料，一步生物酶反应，即可获得果糖含量高于90％的高果糖浆，工艺简单，产 量高。但高活性的菊粉酶是制备高果糖浆的关键。第二方面，是生物能源领域的 应用。目前，生物乙醇的生产主要是以玉米淀粉为原料，原料的种植面临与人用 粮食争夺土地的尴尬。菊芋的主要成分菊粉，它的生长条件粗狂，种植可不占用 耕地，不仅能生长盐碱地，还能生长在荒漠地区，能防止土地沙化，以菊粉为原 料生产生物乙醇可以成为目前淀粉乙醇的补充和后备方法。菊粉在菊粉酶的作用 下，水解成单糖，能直接被酵母利用，产生乙醇。因此，菊粉酶的生产成本直接 影响了菊粉乙醇的成本，是用菊粉做原料制备乙醇的关键。

菊粉酶来源非常广泛，据不完全统计，产菊粉酶的有丝状真菌17个属50余 种，酵母菌10个属20余种，细菌12个属10余种(Pandey，A.，C.R.Soccol， P.Selvakumar，V.T.Soccol，N.Krieger，and J.D.Fontana.1999.Recent developments in microbial inulinases.Its production，properties，and industrial applications.Appl.Biochem.Biotechnol.81：35-52)。但具有 生产价值的菊粉酶的生产，一般选用驯化过的菊粉酶产生菌，如曲霉、克鲁维酵 母等；也可以通过基因工程菌的方法。后者因经过基因工程改造，使菊粉酶的产 量更高，因此更具竞争性。但目前已经报道的基因工程菌生产的菊粉酶，主要是 用嗜甲醇的毕赤酵母表达系统生产(王建华，王明华等，2004，一种外切菊粉酶 的生产方法，中国发明专利CN1495252A)，这种制备菊粉酶的方法，需要甲醇诱 导表达，生产出的菊粉酶在制备食品级高果糖浆的应用中受到限制；另一方面， 这种制备方法，发酵原料成分复杂，发酵时间长，发酵产生的酶产量依然低下， 使得生产菊粉酶的成本较高。

发明内容

本发明的目的之一是获得一种组成型表达的菊粉外切酶鹰嘴豆克鲁维酵母 基因工程菌株，从而避免在发酵过程中在培养基中添加甲醇，并降低生产成本。

本发明的另一个目的就是获得一种由所述基因工程菌发酵生产菊粉酶的方 法。

本发明提供了一种含有菊粉外切酶(即菊粉酶，NCBI登陆号为AF178979) 基因序列的基因工程菌株，即采用基因工程方法将菊粉外切酶基因克隆到真核表 达载体pUKDS上，并转化鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U(CCTCC No：M202031)，从而 构建获得组成型表达的菊粉外切酶克鲁维酵母基因工程菌株。