[发明专利]急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML－RARα－hGM－CSF及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF，其特征在于，所述DNA疫苗由pIRES质粒、PML-RARα基因和hGM-CSF基因组成，所述PML-RARα基因序列如下：

CAAAGCGTCTCCAATACAACGACAGCCCAGAAGAGGAAGTGCAGCCAGA

CCCAGTGCCCCAGGAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGAGGAGGGGAAGGAGGCAAGGT

TGGCTCGGAGCTCCCCGGAGCAGCCCAGGCCCAGCACCTCCAAGGCAGTCTCACCACC

CCACCTGGATGGACCGCCTAGCCCCAGGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGC

CCAACAGCAACCACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGAGCA

GCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACA

AGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACCGC；

所述hGM-CSF基因序列如下：

AGGTCTAGAACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGC

CTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCT

GGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGT

AGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAAT

GTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACA

AGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATG

ATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTG

TGCAACCCAGACTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACT

TTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGAATGT

CGACTCT。

2.权利要求1所述的一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)首先提取NB4细胞的RNA通过逆转录合成cDNA，然后利用引物P1和P2通过PCR扩增出PML-RARα基因；扩增的PCR产物标记为PML-RARα，其大小为384bp；

所述的P1：5’CAAAGCATGGTCTCCAATACAACGA 3’，其中，方框内GCTAGC为NheI酶切位点；

所述的P2：5’GCGTCAGTCCTGACAGACAAAG 3’，其中方框内ACGCGT为MluI酶切位点；

将扩增的基因PML-RARα利用T4 DNA连接酶与pIRES质粒进行连接，插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构建出pIRES-PML-RARα；

(2)然后通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因

以pORF-hGM-CSF质粒作为模板，用引物P3和P4 PCR扩增hGM-CSF基因，扩增的目的片断hGM-CSF基因长度为458bp；上游引物为P3，下游引物为P4；

所述的P3：5’AGGACCATGTGGCTGCAGAGC 3’；其中，方框内TCTAGA为Xba I酶切位点；

所述的P4：5’AGAATTCACTCCTGGACTGGC 3’；其中，方框内GTCGAC为Sal I酶切位点；

(3)将上述扩增得到的hGM-CSF基因利用T4 DNA连接酶与pIRES质粒进行连接，插入到pIRES-PML-RARα的多克隆位点B中，经过测序正确后，构建了pIRES-PML-RARα-hGM-CSF质粒。