[发明专利]唐鱼生长激素基因及其真核表达载体与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说涉及唐鱼生长激素基因、含有该基因的重组表达载体、用该载体转化的唐鱼以及对该转基因唐鱼的外源基因检测。

背景技术

转基因鱼是目前国内外获得最成功的转基因动物之一。转基因鱼的构建主要包括以下几个方面：1.目的基因的获得；2.基因克隆与表达载体的构建；3.受体鱼(受精卵)的获得；4.注射基因。

转基因鱼的应用潜力：

1.快速育种。传统的品种选育需经过多代反复选种交配才能育成优良品种。转基因技术有可能在很短时间内超越自然界亿万年生物进化历程，创造自然界原来没有的品种或品系，这是常规育种难以办到的，故此引诱力极强。

2.改良养殖性能，如加快受体鱼的生长、提高饵料利用率及抗逆性等。不少实验表明，转基因鱼生长速度可提高11％-30％，即所谓“超级鱼”。但这些结果多为实验室环境所得，尚待养殖生产环境的检验。有的转基因鱼可提高饵料利用率，有的则表现出耐寒或耐热、耐低盐度或高盐度、耐高浓度重金属、耐污染物以及乃缺氧等，产生抗逆性较强的鱼。

3.生产医药生物制品。通过转基因鱼生产生物活性物质以满足医药需要，生产对外来物质成阳性的反应器的鱼以满足医疗的需要，研制携带人类胰岛素的转基因鱼以提供胰岛素的研究也开始引起了人们的重视。

唐鱼(Tanichthys albonubes)属鲤形目、鲤科、唐鱼属。它体形细小，长而侧扁。体高约等于头长，腹部圆、吻钝而短，口上位。口裂向下倾斜，几乎与体铀垂直。上颌长于下颌，前端无突起。口无须，眼大，侧上位。背鳍短，起点显著在腹鳍起点之后，胸缩短，末端不达腹部起点，腹缩末端可达肛门，肛门紧靠臀鳍起点。臀鳍较长，约与背鳍相对。尾鳍叉形，末端尖，上下叶约等长。体被中等大小圆鳞，体侧鳞片上无侧线。体侧颜色鲜艳，体侧从鳃孔上角至尾柄基部有一条金黄色的条纹.条纹上下各有几条黑色线条。尾柄基部有一红色大圆斑，背鳍和尾鳍基部有许多红色小斑点。背鳍和臀鳍呈黄绿色，边缘透明。唐鱼分布在广东省广州附近的小山溪中，具有很高的观赏价值。唐鱼现已列为国家二级保护动物。

唐鱼是对生存环境要求极高的鱼种，可成为测定环境品质的“指标鱼”，是用生物方法监测环境水质污染的一个极好的鱼类生物标记物，所以对它的生长发育进行转基因研究，对环境资源和生物资源的保护，具有极大的科学意义。

转基因鱼具有表达量高、世代周期短、成本低、不带哺乳类病毒等优点，且作为生物反应器更易被接受，因此通过转基因获得较大体型、生长快的转基因唐鱼，及该转基因体系方法的建立对后续的研究(如培育可生产重要的蛋白的转基因鱼等)具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种唐鱼生长激素基因。

本发明的另一目的在于提供包含上述唐鱼生长激素基因的重组表达载体。

本发明的另一目的在于提供包含上述唐鱼生长激素基因的基因工程菌。

本发明的进一步目的在于提供上述唐鱼生长激素基因在促进鱼类生长中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明根据GENBANK上已登陆的鱼类生长激素基因cDNA序列，在同源保守区内设计了一对引物(p1和p2)，然后提取唐鱼总RNA，以总RNA为模板，P1和P2为引物，RT-PCR得到唐鱼生长激素基因开放阅读框(ORF)，再根据该ORF设计引物，以唐鱼总RNA为模板，分别进行5′RACE和3′RACE，扩增得到5′末端序列和3′末端序列，然后将5′和3′端序列及核心序列ORF用Vector软件拼接获得了唐鱼生长激素基因的cDNA序列，全长1145bp。

本发明根据唐鱼生长激素基因ORF设计一对引物P6和P7，再以唐鱼生长激素基因ORF为模板，用引物P6和P7进行PCR改造，然后将PCR产物双酶切纯化；同时双酶切转基因表达载体pTLA-DsRed，并回收含有启动子的载体；T4连接酶按照摩尔数比1∶3，连接酶切纯化后的唐鱼生长激素基因ORF和含有启动子的载体。

本发明将上述T4连接酶得到的连接产物转化大肠杆菌后通过菌落PCR，并提取质粒进行双酶切初步筛选重组质粒，该重组质粒测序列证实，重组转基因表达载体构建正确，命名为pTLA-GH。

本发明将转基因表达载体pTLA-GH酶切使其线性化，纯化后测定OD值，调整浓度，将pTLA-GH显微注射到唐鱼受精卵中。