[发明专利]变形杆菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒

权利要求书

1.一种变形杆菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为变形杆菌的ureR---GenBank登陆号：Z18752，所述引物与所述靶基因的586位---810位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

2.一种变形杆菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

正向外引物F3-ure    GGTGAGATTTGTATTAATGGGC

反向外引物B3-ure    ATAATCTGGAAGATGACGAGTA

正向内引物FIP-ure

TGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA

反向内引物BIP-ure

TTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC可以扩增变形杆菌的ureR基因序列的586位---810位的核酸序列的一部分或其互补链。

3.根据权利要求2所述的一种变形杆菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组可以扩增变形杆菌的如下片断或互补链：

所述正向外引物F3：扩增始于586-607bp；

所述正向内引物FIP：扩增始于654-678bp的互补序列和608-628bp；

所述反向外引物B3：扩增始于789-810bp的互补序列；

所述反向内引物BIP：扩增始于685-708bp，和745-768bp的互补序列。

4.一种变形杆菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在变形杆菌，其特征在于，以变形杆菌的ureR基因序列的586位---810位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。

5.根据权利要求4所述的一种变形杆菌的检测方法，其特征在于，具体检测方法为：

1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板DNA；

2)变形杆菌的环介导等温扩增

取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul～100ul的反应体系，混匀点离后在约60-65℃条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶。

反应总体积20ul～100ul的反应体系为：

  成分  终浓度或量  待检模板  核酸模板  1-10ul   扩  增  反  应  液  正向内引物FIP-ure  反向内引物BIP-ure  正向外引物F3-ure  反向外引物B3-ure  甜菜碱betaine  dNTP  mgsO₄  反应缓冲液Bst DNA Polymerase Buffer 10×  1.0-2.0uM  1.0-2.0uM  0.15-0.3uM  0.15-0.3uM  0.8-1.5M  1.0-1.6mM  2-6mM  1/10反应体积(ul )  酶  Bst DNA Polymerase  0.16-0.64U/ul  双蒸水  ddH₂O  加至预定反应体积(ul)

其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA酶。。

3)LAMP反应产物的检测：

A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，

B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I invitrogen1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，

C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在160bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。