[发明专利]HLA－B基因分型用微阵列芯片的制备及其用法

说明书

所属技术领域 

本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及采用DNA微阵列芯片技术和双温度杂交方法，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对HLA-B基因进行分型。 

技术背景 

HLA(Human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统(MHS)，HLA(人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人类第6号染色体6p21.3区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。HLA存在多个基因座位，其中HLA-B座位是影响移植排斥反应的主要座位之一。SNPs是决定组织相容性的本质因素，个体之间的SNPs差异程度决定着相容性程度。HLA-B基因座位的SNPs主要集中在第二外显子长度约300bp的片段上。根据SNPs的差异特点，可以进行基因分型，将HLA-B基因座位分成不同的型别和亚型，型别和亚型相同者，SNPs差异较小，相容性好，反之亦然。HLA基因分型技术广泛应用于造血干细胞移植、器官移植、疾病关联研究。 

HLA-B基因分型方法是从90年代开始发展起来的，目前主要包括PCR-SSP(PCR-序列特异性引物法)、PCR-SSOP(PCR-序列特异性寡核苷酸探针法)、SBT(测序法)、FCM(流式法)方法。这些方法目前被西方国家的少数企业垄断，我国处于空白状态，完全依赖进口。同时，这些方法也存在一些技术问题，比如引物过多造成检测错误、探针杂交单一温度造成特异性降低、检测通量过小等等。 

DNA微阵列法是近几年发展起来的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序(Sequencing by hybridization，SBH)等，为“后基因组计划”时期基因功能研究及现代医学科 学、医学诊断学的发展提供了强有力的工具。 

发明内容

鉴于现有HLA-B基因分型方法的不足，本发明将DNA微阵列技术应用于HLA-B基因分型，开发了一种新型的基因分型试剂盒。 

本发明所采用的技术方案是：针对HLA-B基因座位的第二、三外显子，设计二套特异性寡核苷酸探针(附表1)，采用自动点样机器人，将二套探针印制在两张玻片的特定区域，每张玻片印制16个微阵列矩阵，这样就制成高密度DNA微阵列，二张芯片可以检测16个样本，再配以其它必要的组份，包括PCR引物(表2)组成完整的试剂盒。实际检测时，取16份人基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出人基因组HLA-B基因的第二、三外显子单链CY3标记片段。取DNA微阵列玻片一对，在第一张玻片的16个杂交区域，分别加入16种PCR产物2ul和杂交液8ul；在第二张玻片的对应区域，加入同样的成分。将一对玻片放在自动杂交洗涤仪的两个杂交槽内，分别将第一、二张玻片的杂交温度设定为52℃和45℃，杂交时间30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GenePix4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本基因型别结果。 

本试剂盒采用高密度DNA微阵列技术，可以大大提高检测通量，每二张玻片可以制备用于检测16个样本的DNA微阵列，一般是现有检测技术的10倍以上；同时，由于采用了双片双温度杂交的特殊方法，避免了现有产品因为杂交温度不适造成的探针杂交结果假阳性和假阴性问题，大大提高了产品的特异性。 

本发明针对HLA-B第2、3外显子基因序列的多态性，设计63种分型用寡核苷酸探针，探针分为两组，见表1，第一组45种探针，杂交温度为52℃；第二组18种探针，杂交温度45℃。 

表1HLA-B基因分型寡核苷酸探针