[发明专利]重组VPAC1受体特异激动剂RVPAC1－A及其表达方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及一种重组VPAC1受体特异激动剂RVPAC1-A及其表达方法与应用。

背景技术

VPAC1受体属于G蛋白偶联受体家族，是7次跨膜蛋白，是PACAP和VIP共同受体，它对VIP和PACAP具有同样的亲和力，VPAC1受体在机体内分别广泛：在中枢及周围神经系统，肾上腺，胰腺，睾丸，卵巢，肠道，血管等多个内分泌、消化、循环及生殖等系统、器官与组织均有分布，而且介导多种重要的生物学功能。例如Kojima M等通过急性胰腺炎实验发现，VPAC1特异激动剂能够明显地降低血清淀粉酶，IL-6，TNF，并且呈剂量依赖型降低，能够减轻急性胰腺炎胰腺炎的症状，而VPAC2特异激动剂则起相反的作用。而M R Nicol等发现，VIP刺激H295人类肾上腺皮质癌细胞后能促进肾上腺皮质激素及促肾上腺皮质激素分泌，且呈剂量依赖型分泌。用VPAC1特异激动剂刺激H295的效果与VIP相似，而VPAC2特异激动剂的作用却不明显。用VIP刺激H295人类肾上腺皮质癌细胞后，real-time PCR检测到VPAC1受体转录本的量是PAC1受体的1000倍，因此他们推断VIP刺激H295细胞分泌肾上腺皮质激素及促肾上腺皮质激素是通过VPAC1受体介导的。Tamalcawa等发现应用链脉佐菌素(50mg/kg)制备糖尿病大鼠，胰腺的PACAP免疫活性物质增加30％在其他组织中，只有下丘脑中PACAP免疫活性物质增加10％。逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)分析发现在链脉佐菌素诱导的糖尿病大鼠的胰腺组织中，VPAC1-R的mRNA相对于其他两种受体的mRNA显著增加，表明PACAP和VPAC1-R可能与了糖尿病高血糖的病理生理过程有关。另有研究发现VPAC1受体与T细胞感染HIV-1病毒的效率有关。

综上可见，VPAC1受体具有调节免疫，能量代谢，内分泌等多种重要的生物学功能。VPAC1受体特异激动剂在VPAC1受体研究及应用方面具有巨大的价值。

目前有多条已报道的VPAC1受体特异激动剂：

①[K15，R16，L27]VIP(1-7)/GRF(8-27)

由VIP和GRF为基础突变而来，主要与VPAC1结合，PHILIPPEGOURLET等人通过研究证明：此短肽对小鼠和人的VPAC1受体都具有非常高的亲和力，而对PAC1及VPAC2受体的亲和力非常低，是最为经典的VPAC1受体特异激动剂。

②[Ala11，22，28]VIP

由VIP的11，22，28位氨基酸突变而来，Pascal Nicole等^[56]人证实，[Ala11，22，28]VIP对VPAC1受体的亲和力高于其对VPAC2受体的亲和力1000倍以上。

③[R(16)]-PACAP(1-27)

由PACAP27第16位氨基酸突变为R获得，依赖VPAC1的穿膜区起作用。

④[L(22)]-VIP

由VIP第22位氨基酸突变获得，依赖VPAC1的N端膜外区起作用。

此外已报导的VPAC1受体特异激动剂还有：

[Tyr9，Dip18]VIP(1-28)；VIP(4-28)；VPAC1的特异拮抗剂[Acetyl-His1，D-Phe2，Lys15，Arg16]VIP(3-7)GRF(8-27)-NH2。

以上所有多肽均采用化学合成，目前没有应用生物工程技术和原理，实现以上任何多肽高效制备的方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种重组VPAC1受体激动剂RVPAC1-A。

本发明的另一个目的是提供上述重组VPAC1受体激动剂RVPAC1-A的表达方法。

本发明的进一步目的是提供上述重组VPAC1受体激动剂RVPAC1-A的应用。

根据RVPAC1-A的氨基酸序列，设计在原核表达的基因，采用基因工程的原理和技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽的高效制备。具体包括如下步骤：

(1)设计并合成RVPAC1-A基因序列，如SEQ ID NO：1所示。

采用3条引物两步法合成RVPAC1-A基因：引物F1和F2进行链延伸反应；然后以其产物为模板，以F1和F3为引物，进行PCR；所述引物F1-3的核苷酸序列如下所示：

F1：