[发明专利]红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法及其试剂盒和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液检测技术，尤其是指一种红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法，本发明还涉及用于红细胞G6PD缺乏症检测试剂盒及该试剂盒的使用方法。

背景技术

红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患者是我国常见的遗传病，发病率在长江以南各省很高(约3～16％)，我国有约1亿G6PD缺乏症患者，该病特征是平时无症状，但患者的红细胞容易受到某些特定物质的破坏而发生溶血，导致溶血性贫血、药物溶血、蚕豆病等，最严重的是新生儿溶血，导致核黄疸从而发展为儿童终身智力低下或死亡。由于G6PD基因定位于X染色体上，男性只有一条X染色体，男性G6PD缺乏者的酶缺乏很明显，酶活性低下容易被测出；但是女性有两条X染色体，通常只有一条染色体发生病变，而另一条X染色体上有一个正常的G6PD基因，所以女性酶缺乏者不明显，以致病基因携带者(杂合子)普遍存在人群中；但是女性杂合子会将致病基因传给下一代，如在她们妊娠、生产、哺乳期发生急性溶血，会导致新生儿溶血、新生儿核黄疸或发育生长迟缓。

对红细胞G6PD定性定量测定，自50年代起已经建立了多种方法，经过40多年的筛选，现在只有紫外分光关度法、高铁学红蛋白还原试验(MetHB)和四氮唑蓝(NBT)定性定量法和手工双酶比值法得到应用。其中的紫外分光关度法的杂合子检出率为38.5％，高铁学红蛋白还原试验的杂合子检出率为50.8％；而手工双酶比值法是本申请的发明人经过近40年的研究提出的，它是利用人红细胞戊糖代谢的关键酶葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)催化葡萄糖6磷酸(G6P)转化为6磷酸葡萄糖酸(6PG)时，伴有氧化型辅酶II(NADP)转化成还原型辅酶(NADPH)，NADPH产生后，在酚嗪二甲酯硫酸盐(PMS)递氢的促进下，NADPH的H离子，将传递给氧化型硝基四氮唑蓝(黄色，NBT)，使之转变为还原型NBT(蓝色)，用分光光度计650nm光密度比色可以测出蓝色的深浅，即NADPH生成量(S1)由此间接反映G6PD活性；因人体内酶的活性在血标本内保存极不稳定，而且，外源性G6PD活性的质量控制品不易获得。如果仅测G6PD活性，就很难排除因其它原因引起的G6PD活性降低(如病人贫血、标本溶血、凝血、陈旧、污染等)，因而造成误诊。人红细胞戊糖代谢的另一同功酶6磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)也有将NADP转化成NADPH的作用，当6PGD催化6PG转化为5磷酸核酮糖(5’PR)时，伴有NADP转化成NADPH，同样，NADPH产生后，在PMS递氢的促进下，NADPH的氢离子将传递给氧化型NBT(黄色)，使之转变为还原型NBT(蓝色)，用分光光度计650nm光密度比色可以测出蓝色的深浅，即NADPH生成量(S2)，由此间接反映了6PGD活性，目前，没有6PGD缺乏的个体，同时测定6PGD活性可以设置了内质控，通过两个酶的活性生成的产物NADPH，催化氧化型NBT再生成还原型NBT的光密度比值计算(S1/S2)，间接判断出G6PD活性，其杂合子检出率可达76.9％。但手工双酶比值法存在工艺流程长，对样品只能逐个检测，一天最大限量只可检测20～30个样品，每个样品反应量为2060μl×2等不足。

因此，提供一种检测更为直接、结果准确、快速、杂合子查出率高的G6PD缺乏症检测方法，是降低该病发病率和预防新生儿核黄疸的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测更为直接，准确、操作简便、，成本低、易于推广的红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种可实施上述方法的临床检测用试剂盒。

本发明要解决的再一个技术问题是提供一种更为快速的使用上述试剂盒的检测方法。

本发明的前一技术方案是这样的：一种红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法，其特征是包括下述步骤：(1)制备待检测人的抗凝全血溶血液；(2)测试溶血液的葡萄糖6磷酸脱氢酶促葡萄糖6磷酸转化6磷酸葡萄糖酸的反应中生成产物还原型辅酶II在340nm波长处的特征性光吸收，间接地测出葡萄糖6磷酸脱氢酶酶促反应中的活性A；(3)测试溶血液的6磷酸葡萄糖酸脱氢酶促6磷酸葡萄糖酸转化成5磷酸核酮糖的反应中生成产物还原型辅酶II在340nm波长处的特征性光吸收，间接地测出6磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶促反应中的活性B；(4)计算A与B的比值，葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症患者该比值小于1.0。