[发明专利]一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒，其特征在于：

1)第一次PCR反应液体系：PCR反应缓冲液22.5μl、引物F20.5μl、引物R2 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl；

2)第二次PCR反应液体系：PCR反应缓冲液22.5μl、引物F30.5μl、引物R3 0.5μl、Taq DNA聚合酶0.5μl；

其中，第一次PCR反应引物为：

F2：5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3’；R2：5’-CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3’；

第二次PCR反应引物为：

F3：5’-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3’；R3：5’-CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3’；

第一次PCR和第二次PCR反应液体系中PCR反应缓冲液含有：10mMTris-HCI，pH8.3；50mM KCI、1.5mM MgCI2、dNTP 0.2mM；

3)阳性对照DNA 1μl；

所述阳性对照DNA为转基因大豆DNA。

2.一种按权利要求1所述的适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒的检测方法，其特征在于：

1)提取模板DNA：

称取1-10g转基因大豆的原料，加入10-100ml预冷的提取缓冲液混匀；加入预热60-70℃的裂解缓冲液混匀；60-70℃温育30-60min；冷却后加入5-50ml氯仿、异戊醇和乙醇的混合液混匀，室温放置3-10分钟；而后在10000-13000rpm离心8-15min，取上清液并在上清液中加入5-50ml酚和氯仿混合液混匀，室温放置3-10分钟；再以10000-13000rpm离心8-15min取上清液；上清液中加入其体积2/3的预冷异丙醇，-20--40℃放置20-30min，10000-13000rpm离心10-15min，即得到提取模板DNA，待用；

2)进行转基因检测：

步骤1)得到的DNA模板液取1μl加入PCR反应缓冲液，并加入引物F2和R2各0.5μl以及TaqDNA聚合酶0.5μl，混合均匀，而后在94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸10min；得到第一次PCR扩增产物，取1μl第一次PCR扩增产物加入无菌双蒸水进行50-100倍稀释，而后取1μl稀释液加入PCR反应液缓冲液中，并加入引物F3和R3各0.5μl以及TaqDNA聚合酶0.5μl，混合均匀，以上述PCR反应条件进行第二轮扩增，得到扩增产物；

F2：5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3’；R2：5’-CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3’；

F3：5’-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3’；R3：5’-CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3’；

将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳和紫外光检测结果，如果存在250bp的DNA条带，证明所检测的原料中含有转基因大豆；

所述步骤1)中提取的模板DNA沉淀在体积浓度为70％乙醇中洗涤1-2次，晾干后，溶于500-1000μl双蒸水中，待用。

3.按权利要求2所述的适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中异戊醇、乙醇和氯仿的体积比为4∶20∶76；酚和氯仿体积比为1∶1；提取缓冲液为0.8M NaCI；50M Tris-CI，10mM EDTA；pH8.0；裂解缓冲液为0.8M NaCI；50M Tris-CI，10mM EDTA；20％CTAB；pH8.0。

4.按权利要求2所述的适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述预冷的异丙醇预冷温度为4℃。