[发明专利]制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域，涉及一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法以及利用所述方法获得的致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。

背景技术

恶性肿瘤已成为威胁人类健康、生存的主要疾病之一。肿瘤的常规疗法如手术、放疗、化疗的基本着眼点都是借助“外力”直接用手术切除肿瘤或用电离辐射或化疗药物来杀伤肿瘤细胞。其主要问题也就在于通过手术或放疗、化疗不一定能完全摘除或彻底消灭肿瘤细胞，难以解决转移和复发；同时常有明显的损伤和毒、副作用，会损害正常组织细胞，特别是化疗、放疗的毒副作用会伤害在机体抗肿瘤防御中占重要地位的免疫系统，尤其是影响细胞免疫。在现代肿瘤学、分子生物学、免疫学理论、生物技术和基因工程技术发展的推动下，以免疫治疗为基础发展而来的生物治疗日益受到重视。此外，生物治疗的应用始于抗癌，但绝不仅限于抗癌，它对感染、免疫缺陷、自体免疫性疾病等的防治，以至移植排异和抗衰老等都有着重要价值。

肿瘤生物治疗是应用各种生物活性制剂和方法来激发调动、调节机体的免疫功能和抗癌能力，从而抑制或消除肿瘤生长的治疗方法，是一项具有巨大治疗潜力的疗法。

治疗性肿瘤疫苗的研究和开发是一个巨大的挑战。本领域目前所面临的状况是依然没有能够获得有效的治疗性疫苗，还没有一种直接针对肿瘤和肿瘤细胞的确实有效的肿瘤疫苗来可靠地增加病人的生存期和消灭肿瘤。

要想建立一种有效的主动特异性免疫疫苗疗法还必需克服以下几个障碍：第一，由于肿瘤抗原本身特异性差，或者患者的肿瘤负荷、预先的化疗及其他的因素可造成患者总体的免疫缺陷。因此，诱导针对肿瘤抗原的主动特异性免疫治疗免疫应答十分困难；第二，肿瘤细胞的抗原性，特别是人类自发瘤的免疫原性一般都较弱。疫苗免疫可能不易产生足够强的免疫应答使肿瘤消退；第三，抗原表达有肿瘤异质性，因此大多数患者需要对多种抗原同时免疫。第四，开发肿瘤疫苗的主要问题之一是很难建立与人的临床背景相似的理想动物模型。

被动特异性免疫治疗也就是转输肿瘤特异性致敏T淋巴细胞对某些实验动物肿瘤有明显的治疗作用，早在60年代末70年代初就已被证实。但是致敏T淋巴细胞数量少难以达到足够量，某些自发性肿瘤表达的抗原较弱不易引起排斥反应，动物实验中所用的获取致敏T淋巴细胞的方法不适用于人，这些都阻碍了采用致敏T淋巴细胞治疗肿瘤的研究与应用。获得足量的致敏的肿瘤特异性T淋巴细胞是继承性细胞免疫治疗应用的最大难题。

主动非特异性免疫主要是对免疫系统进行非特异性刺激，以期在提高非特异性免疫反应的同时，提高对已有肿瘤的免疫反应。早期的主动非特异性免疫治疗在人体上大多并不成功，且多数已不再应用。非特异性主动免疫治疗对晚期癌症患者几乎都不成功。

被动非特异性免疫治疗肿瘤主要是输注自身或同种非特异性肿瘤杀伤细胞为主。例如LAK/IL-2和TIL/TDAK(肿瘤来源的激活的杀伤细胞)疗法。这些疗法本身还有许多局限或不足之处。例如患者自体LAK前体细胞数量少，扩增能力较低，杀伤效应有限；特别是反复应用大剂量rIL2，往往引起比较严重的毒副作用使患者不能耐受治疗。TIL/TDAK疗法最大的问题是非常耗时、费力、昂贵，这比LAK细胞治疗方法还要明显。TIL的活性取决于肿瘤的类型、大小和坏死程度等，并非所有的肿瘤都被淋巴细胞浸润。事实上自身肿瘤特异的TIL在大多数肿瘤中难以得到。随着培养时间的延长，TIL的增殖活性和抗瘤活性都有所降低，在培养过程中一些细胞发生凋亡。从产生免疫抑制因子的肿瘤中获得的TIL在体外可能不增殖，从转移瘤中获得的TIL在培养中也不易扩增。因此如何筛选这些具有高肿瘤反应性的淋巴细胞亚群并在体外扩增，将是TIL/TDAK的重要课题。

因此，目前迫切需要一种开发肿瘤疫苗的新概念、建立了一种制备肿瘤疫苗的的新方法，以克服以上各种目前所常用的免疫治疗方法的不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群体的方法以及用所述的方法获得的具有抗肿瘤免疫应答反应效应的细胞群。

在本发明的第一方面，提供一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法，所述的方法包括：

(1)将肿瘤与单个核细胞置于三维细胞培养装置中共同培养，从而获得含有具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的培养物；

(2)从步骤(1)获得的培养物中分离具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。

其中，所述的三维细胞培养装置包括：

(a)容器，在容器内装有液态细胞培养基；以及