[发明专利]用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过使用产生耐酸的重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞来生产脂肪酶的方法，该方法允许生产能用作药物的脂肪酶；本发明还涉 及一种过度产生耐酸重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株及其应用。

背景技术

人类每日摄取的食品主要由脂类、蛋白质和糖组成。在它们被吸收之前，所有这些组 成要经受消化道内的酶的催化水解。这些酶中任何一种的缺乏可以因此引起消化紊乱，并 且导致相当严重的营养不良。即，例如，在一些病态情况的病例中，比如囊性纤维化或外 分泌胰腺的不足与胰脂酶缺乏有关。为校正这些缺乏，通常建议口服给药胰腺提取物。然 而，这些疗法的效率受限于如下事实：这些提取物中所含的酶(脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶) 会因胃介质的酸性而快速失活。

因此，有人建议使用抗胃环境的脂肪酶制剂，比如，其例子有通过基因工程生产的哺 乳动物胃脂肪酶制剂，比如申请人为于文尼尔研究股份公司(INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL SA)的法国专利申请公开2 699 179描述的制剂、或者在酸性介质中具有适 当活性的微生物脂肪酶制剂[ZENTLER-MONRO等，Pancreas，7，311-319(1992)]。

在酸性介质中有活性的微生物脂肪酶中，可能会尤其提到真菌脂肪酶，比如来自欧诺 比假丝酵母(Candida ernobii)[YOSHIDA等，Biochim.Biophys.Acta.；154，586-588(1968)]、 来自星状丝孢酵母(Trichosporon asteroid)[DHARMSTHITI等，Biotechnol.Appl.Biochem.， 26，111-116(1997)]、来自爪哇根霉(Rhizopus javanicus)[UYTTENBROECK等，Biol.Chem. Hoppe Seyler，374，245-254，(1993)]、或来自解脂耶氏酵母[HADEBALL，Acta Biotechnol.，2， 159-167(1991)；NOVOTNY等，J.Basic Microbiol.28，221-227(1988)]的那些真菌脂肪酶。除 了它们在酸性pH下的活性之外，这些脂肪酶当它们的底物存在时，具有通常的抗蛋白酶 (胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶)消化的特性，并且具有抵抗胆盐作用的特性(当存在 10mM牛磺胆酸钠时它们的活性可保持)。

已经有人描述了解脂耶氏酵母用于生产所研究基因的应用。因此，申请人为INRA和 CNRS的专利申请EP 1 108 043描述了包含所研究基因的表达盒和Zeta序列(zeta sequences)的整合载体的应用，该整合载体对应于解脂耶氏酵母Ylt逆转录转座子的LTR 序列。这样的表达载体允许将插入所研究基因的数个拷贝非同源地并且分散地整合入缺乏 Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株的基因组DNA中。该系统尤其已经用于将编码脂肪酶的LIP2 基因整合入解脂耶氏酵母DNA，并且已经允许在培养基条件(未详述)下，与未转化的菌 株相比，转化菌株分泌的脂肪酶量高出10至15倍。

其他研究描述了如专利申请EP 1 108 043所述的相同表达载体用于在解脂耶氏酵母中 产生重组体脂肪酶的应用(国际申请WO 01/83773；PIGNEDE等，Journal of Bacteriology，vol. 182，No.10，p.2802-2810(2000)以及PIGNEDE等，Applied and Environmental Microbiology， vol.66，No.8，p.3283-3289(2000))。具体为：