[发明专利]蛋白功能的体外分子进化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白功能的体外分子进化方法，其允许控制引入选择 的母蛋白质区域的变异性。

背景技术

可通过包括定点诱变(Alber et al.，Nature，5；330(6143)：41-46， 1987)、组合克隆(Huse et al.，Science，246：1275-1281，1989；Marks et al.， Biotechnology，10：779-783，1992)以及同适当的选择系统组合的随机诱 变(Barbas et al.，PNAS.USA，89：4457-4461，1992)的多种体外方法修饰 和改善蛋白功能。

已经在许多情况下使用了同选择共同使用的随机诱变方法以改善 蛋白功能，且存在两个不同的策略。首先，随机化整条基因序列并结 合选择具有期望特性的变体(突变)蛋白，然后是新一轮的随机诱变 和选择。然后可重复该方法直至发现认为是优化的蛋白变体(Schier R. et al.，J.Mol.Biol.1996 263(4)：551-567)。在这里，引入突变的传统途 径是通过具有大约0.7％突变率的易错PCR(Leung et al.，Technique，1： 11-15，1989)。其次，可使用允许高达100％突变率的简并引物诱变基因 的确定区域(Griffiths et al.，EMBO.J，13：3245-3260，1994；Yang et al.，J. Mol.Biol.254：392-403，1995)。

在抗体工程领域广泛使用了随机突变。可在体外克隆体内形成的 抗体基因(Larrick et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.160： 1250-1256，1989)并且可将编码可变重链和轻链基因的基因的随机组合 置于选择中(Marks et al.，Biotechnology，10：779-783，1992)。可使用随机 诱变和额外的多轮选择进一步改善通过这些方法选择的功能抗体片段 (Schier R.et al.，J.Mol.Biol.1996 263(4)：551-567)。

典型地，随机诱变策略后进行选择。可选择具有目标特性的变体 并且可将来源于每一种均具有目标特性的不同变体的突变DNA区域 组合成一条编码序列(Yang et al.，J.Mol.Biol.254：392-403，1995)。

也已经使用了基因的组合配对来改善蛋白功能，如抗体亲和性 (Marks et al.，Biotechnology，10：779-783，1992)。

另一种已知的用于蛋白功能体外突变的也称为“DNA改组” (DNA shuffling)的方法利用了DNA的随机片段化和片段组装成功能 编码序列(Stemmer，Nature 370：389-391，1994)。DNA改组方法通过重 组组合来源于单个基因的有用突变而产生多样性。不同蛋白，如酶和 细胞因子的人工进化已经成功使用了该方法(Chang et al.Nature Biotech.17，793-797，1999；Zhang et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94， 4504-4509，1997；Christians et al.Nature Biotech.17，259-264，1999)。使 用DNA酶I将基因随机片段化，然后通过彼此间重组进行重新组合。 起始材料能是单个基因(使用易错PCR第一个随机突变的)或天然发 生的同源序列(所谓的家族改组)。

DNA酶I优先在靠近嘧啶核苷酸的位点水解DNA，因此，它是 DNA随机片段化的合适选择。然而，该活性依赖于Mg或Mn离子， Mg离子限制了片段大小到50bp，而Mn离子将给出低于50bp的片段 大小。因此，为了拥有用于重组的所有可能的大小，上述基因需要用 DNA酶I在存在两种不同离子之一的情况下处理至少两次，然后除去 这些非常相同的离子。

尽管，在理论上，在任何克隆间改组DNA是可能的，假如产生的 改组的基因关于表达和活性是有功能的，优选地，除了低水平的随机 突变，待改组的克隆必须是相关的或甚至是相同的。遗传上不同的克 隆间的DNA改组通常生产非功能性基因。

发明内容

本发明寻求提供体外蛋白进化的改善方法。特别地，本发明的目 标是提供允许控制引入选择的母多核苷酸序列的区域内的变异性程度 的方法。