[发明专利]蛋白功能的体外分子进化方法

权利要求书

1.用于从母多核苷酸序列产生多核苷酸序列或序列的群体的方法，该 方法包括下述步骤

(a)提供多核苷酸分子的第一群体和多核苷酸分子的第二群体， 第一和第二群体共同组成母多核苷酸分子的正链和负链；

(b)用核酸酶消化多核苷酸分子的第一和第二群体以生产多核苷 酸片段；

(c)将产生自正链的所述多核苷酸片段与产生自负链的片段在允 许片段退火的条件下接触；和

(d)扩增退火到彼此的片段以产生至少一条其序列不同于母多核 苷酸分子的多核苷酸分子

其中通过加入一条或更多条具有预决的变异性的寡核苷酸控制在 步骤(d)中生产的至少一条多核苷酸分子的选择区域内的序列变异性 程度，该寡核苷酸退火到位于母多核苷酸分子的3’和5’末端核苷酸间 但排除3’和5’末端核苷酸的序列上。

2.根据权利要求1所述的方法，其中母多核苷酸编码一个或更多个蛋 白基序。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中多核苷酸的第一和第二群体 是cDNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其中多核苷酸的第一和第二群体是单 链的。

5.根据上权利要求1所述的方法，其中多核苷酸的第一群体由母多核 苷酸序列的正链组成，多核苷酸的第二群体由母多核苷酸序列的负链 组成。

6.根据权利要求1所述的方法，其中将多核苷酸的第一和第二群体单 独地在步骤(b)中进行消化。

7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中的核苷酸酶是外切 核酸酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中外切核酸酶选自BAL31、外切核 酸酶I、外切核酸酶V、外切核酸酶VII、外切核酸酶T7基因6、细菌 噬菌体λ外切核酸酶或外切核酸酶Rec J_f。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中生产的至少一条 多核苷酸序列的改变的氨基酸序列与编码的多肽的改变的性质相关。

10.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤(b)之前或在步骤(b) 中加入具有预决的变异性的寡核苷酸，且其中核酸酶特异于单链多核 苷酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)后步骤(c)前加 入具有预决的变异性的寡核苷酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸 与母多核苷酸序列的内部序列分享至少90％的序列同一性。

13.根据权利要求1所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸 与母多核苷酸序列的内部序列分享95％的序列同一性。

14.根据权利要求1所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸 具有单条核苷酸序列。

15.根据权利要求1所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸 具有至少两条不同的序列。

16.根据权利要求15所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸 是母多核苷酸序列的相同内部序列的变体。

17.根据权利要求15所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸 与母多核苷酸的至少两个不同区域分享至少95％序列同一性或是其变 体。

18.根据权利要求1所述的方法，其中通过易错PCR或使用寡核苷酸 合成仪生产具有预决的变异性的寡核苷酸。

19.根据权利要求1所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸 的长度介于10和500个核苷酸间。

20.根据权利要求19所述的方法，其中具有预决的变异性的寡核苷酸 的长度介于50和200个核苷酸间。

21.根据权利要求1所述的方法，其中母多核苷酸序列编码配体。