[发明专利]整体活体动物中神经系统的非侵入性体内荧光成像

说明书

发明领域

本发明涉及包括对转基因动物中表达的荧光蛋白进行非侵入性成像的方法。

发明背景

帕金森病(PD)是位于阿耳茨海默痴呆症之后居于第二位的最常见的神经变性病症。据估计，仅在美国就有超过一百万个体患有这种致残疾病，并且每年出现超过50,000新病例(Fahn and Przedborski，2000)。作为一种以运动徐缓、静止性震颤、强直和步态障碍为特征的进行性、年龄相关的神经变性疾病，PD还以黑质中多巴胺能神经元的大量进行性破坏为特征。如同很多其它的神经退行性疾病，PD自身主要表现为偶发情况，意味着不存在任何遗传连锁，但是在罕见病例中，PD也可以作为简单的孟德尔性状出现，与多种基因的缺陷连锁。

尽管临床上和病理学上偶发和家族性PD可以在几个重要方面不同，但是它们共有相同的生化脑部异常，即脑多巴胺的显著减少(Dauer andPrzedborski，2003)。PD患者显示低水平脑多巴胺的原因源于黑质纹状体多巴胺能途径的退化，所述多巴胺能途径由多巴胺能神经元构成，其细胞体位于黑质中，伸出的轴突和神经末梢可见于纹状体中(Vila andPrzedborski，2004)。

PD的最佳表征模型已经通过使用神经毒素MPTP而开发出来(Bloemet al.，1990，Flint Beal，2001)。对MPTP的发现发生在1982年，当时加利福尼亚的一群吸毒者表现出严重帕金森综合征的急性发作。研究发现该综合征是由于自身注射一种合成的海洛因类似物而引起，而这种海洛因类似物在制造过程中被副产物MPTP污染。随后，MPTP给药显示在小鼠和灵长类动物中模拟PD。MPTP为高度亲脂的，其可容易地穿过血脑屏障。随后，其被B型单胺氧化酶转化为其活性代谢物-1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP⁺)，然后该活性代谢物被高亲和性多巴胺和去甲肾上腺素摄取系统摄取，并由此在黑质纹状体多巴胺能细胞的线粒体内聚集。这可导致对细胞功能的多种有害作用，引起神经细胞死亡(Tatton and Kish，1997，Tanji et al.，1999)。在小鼠中，2′-CH₃-MPTP是比常规MPTP更为有效的神经毒素，显示严重的组织病理学变化，包括细胞质膨胀、间质水肿、多巴胺能神经元减少以及反应性小神经胶质细胞增殖和神经胶质增生(Abdel-Wahab，2005)。

尽管对PD的大部分研究集中于成体进行，一些报告令人信服地证实对新生小鼠的全身MPTP注射导致永久的脑损伤，在成年期也还有痕迹。发育中的脑对MPTP损伤敏感的事实还值得进一步研究。

除了MPTP，也已报道了多种其它的化学品在成体小鼠脑的不同区域引起神经损伤。这些化学品包括一系列结构和功能上不同的化合物，从工业上有毒的化合物、农业杀虫剂到食品添加剂。同样，迄今为止进行的大部分神经毒性研究基于成体模型。但是，值得注意的是，具有较不完整血脑屏障的发育中的脑更易于受到已知神经毒素的损伤，更关键的是，该施加的损伤不能由发育中的脑完全和正确地代偿。因此，对于测试化合物在发育中的脑中的潜在神经毒性而言，其重要性无论如何强调也不过分，尤其是在处理沉默神经毒性(即，早期暴露于神经毒剂，但是直至成年期才有临床症状)的问题时。美国环保局的发育神经毒性测试指南(Developmental Neurotoxicity Testing Guideline，DNTG)进一步强调了这点。最近，欧委会采纳了用新的欧盟管理框架来通过严格制度测试所有的化学品的建议，据估计新措施耗资高至70亿欧元并需要至少10年来实施。

O′Callaghan(O′Callaghan，1988)已提出，在中枢神经系统(CNS)的星形细胞中优势表达的中间纤维蛋白-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，为监测成体啮齿类动物脑中由各种神经毒剂(包括1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP))引起的神经损伤的早期和灵敏的生物标记(Reinhard et al.，1988，Araki et al.，2001，Chen et al.，2002，Fields and tevens-Graham，2002，Kurosaki et al.，2004)。GFAP表达上调与神经学损伤增加相关。用于分析内源GFAP表达的常规方法主要包括免疫细胞化学、Northern印迹、Western印迹和ELISA(O′Callaghan，1991，Eng et al.，2000)。