[发明专利]骨形态发生蛋白制剂

说明书

发明领域

本发明涉及可冻干的、并且在有机溶剂中稳定的蛋白制剂。本发明也涉及用于植入和控制蛋白局部递送的蛋白/聚合物药物递送装置。

发明背景

骨形态发生蛋白(BMPs)是独特的，因为其诱导间充质细胞向骨系细胞分化，并且增强造骨细胞的分化功能。在整形外科中具有很多用途。

骨形态发生蛋白(单体和二聚体形式)包括TGF-β超家族因子、BMP-2、BMP4、BMP-6、BMP-7、BMP-12、BMP-14、和重组人生长分化因子5(rhGDF-5)。已经采用重组DNA技术生产用于医疗用途的rhGDF-5，其也称作形态发生蛋白52(MP52)。首次分离的rhGDF-5的cDNA作为TGF-β超家族成员(Biochem.Biophy.Res.Comm.，Vol.204，No.2.1994)。随后，高级遗传工程技术使得制备MP52成为可能，而且并不破坏其骨形态发生活性。

典型地，为了达到骨生长诱导的目的，需要持续暴露于BMP数天/星期。因此，BMPs必需与第二种化合物，代表性地是聚合物配制，形成药物递送基质的形式。蛋白质比传统的无机和有机药物要大并且更加复杂，除了复杂的三维结构外还具有多个功能基团。因此，用于治疗用途的这样蛋白制剂，要具有合适剂量形式则存在特殊问题。对于一种蛋白质，如rhGDF-5，要想保留其生物活性，制剂必需至少保持蛋白质氨基酸核心序列的构象完整性，同时保护蛋白质的多个功能基团免于降解。

蛋白/聚合物药物递送制剂中的聚合物基质不仅提供控制蛋白质定量释放速度的机制，而且更重要地，保护未释放蛋白质不与体液直接接触，所述接触可降解蛋白质。

在经历了制备蛋白/聚合物药物递送制剂所需要的制备步骤之后，要保持其生物活性是富有挑战性的。通常用于混合热塑性聚合物的高温经常使蛋白变性。因此，经常在聚合物/溶剂溶液中混合蛋白质制备蛋白/聚合物药物递送制剂，其中的溶剂是聚合物的溶剂。混合步骤后接着进行去除溶剂的步骤，得到最终的蛋白/聚合物制剂。

通常，然而，将蛋白质暴露于有机溶剂可使蛋白质降解。降解蛋白质的途径包括化学不稳定性(也就是任何通过健形成或断裂修饰蛋白质形成新的化合物实体的过程)或物理不稳定性(也就是蛋白质高级结构的变化)。化学不稳定性起因于脱酰胺作用、(外)消旋作用、水解、氧化、β消除或二硫化物替换。物理不稳定性起因于变性、聚集和沉淀，或例如，吸收。三种最通常的蛋白质降解途径是蛋白聚集、脱酰胺和氧化作用。因此，溶剂环境稳定剂对于保持暴露于有机溶剂时蛋白的稳定是至关重要的。

在不存在溶剂环境稳定剂时，rhGDF-5在暴露于有机溶剂如二烷和二氯甲烷后显著降解(化学和物理地)。例如，当有机溶剂是二烷时，由RP-HPLC和非还原条件下十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察到，这种降解是由于聚集或沉淀和非特异位点的氧化作用。暴露于二烷的rhGDF-5样品与温育在0.1％过氧化物溶液中的rhGDF-5样品具有相似的RP-HPLC层析峰图谱。非还原条件下SDS-PAGE检查这些样品时，只观察到对应于完整rhGDF-5的单一条带，显示物理聚集是沉淀的原因。

对于长期储存，蛋白质在干燥状态时通常具有更好的稳定性。冷冻-干燥或冻干法，是保存蛋白质普遍采用的技术，这两项技术均是从所需蛋白质制剂中去除水分。冻干法是使材料干燥的一种方法，首先将材料冷冻，然后通过在真空环境中升华将冰或冷冻溶剂除去。

然而，冷却和干燥过程本身可造成压力导致蛋白质降解。二聚物和其他非溶性蛋白聚集物表明，物理(非-共价)聚集，也导致蛋白损失。因此，在预冻干制剂中必需包含冻干保护剂以增强冷冻-干燥过程中的稳定性和/或提高储存中冻干产品的稳定性。

当蛋白暴露于溶剂时，会变性(解折叠)形成不可逆的聚集。变性蛋白趋向于更易于受不可逆化学过程如蛋白水解、氧化和脱酰胺作用的影响，从而造成蛋白生物活性的损失。

因此，本发明的一个目的是提供可冻干的、并且在有机溶剂中稳定的骨形态发生蛋白制剂。冻干制剂在正常储存条件下稳定贮存。进一步的目的是提供在有机溶剂环境中稳定的骨形态发生蛋白稳定制剂，所述有机溶剂环境适于构成植入和控制所述蛋白局部递送的聚合基质。

发明概述

本发明是蛋白制剂。所述制剂包含骨形态发生蛋白、冻干保护剂，和一定量的有效稳定制剂中骨形态发生蛋白的氧化/还原稳定剂。