[发明专利]一种检测蓖麻毒素的免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种蓖麻毒素的检测试纸及其制备方法。

背景技术：

蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)是一种从蓖麻种子的胚乳中提取的植物蛋白毒素，分子量约为64kDa，两条多肽链分别称为RTA链(Ricin toxin A，RTA)和RTB链(Ricin toxin B，RTB)。RTA是活性链，分子量约为32 kDa。RTB是结合链，分子量约为34 kDa，两者间由二硫键连接。由于蓖麻毒素来源广泛，毒性较高，已被外军作为武器化的一种毒素加以研究，禁止化学和生物武器公约把蓖麻毒素列为最为严格的控制对象之一。尤其是自美国“9.11”恐怖袭击后，随着多个恐怖组织和极端分子研制、拥有并携带蓖麻毒素惊现英国首都伦敦，使这种致命的毒素成为最有可能被用作恐怖袭击的生物毒素。

由于气溶胶化的蓖麻毒素微粒无色无味，不易被发现，因此侦检非常困难。历史上最初是用动物实验测定蓖麻毒素的毒性和定量检测。现阶段则根据蓖麻毒素所具有的理化特性、生化特性和免疫原性发展出多种检测法，其中以免疫检测法为主^[1]。

免疫检测法多是依赖于抗原抗体反应的免疫学方法，包括多克隆和(或)单克隆抗体为基础的放射免疫法或酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫层析试验和电化学发光生物传感器，其中ELISA法是国际规定的检测蓖麻毒素的金标准。但是，不同的检测方法检测蓖麻毒素的敏感性有差别。其中，免疫荧光技术(FIA)的灵敏度为4～20pg/mL，放射免疫技术(RIA)为0.006pmol，ELISA法则可检测至100pg/mL^[2-3]。

另外，与传感器技术相结合，现已开发用于侦检和鉴定蓖麻毒素和其他生物毒素的生物传感器，如电化学发光传感器(ECL)和光纤生物传感器，灵敏度均在ng-fg水平。其中，美国所研制的生物传感器始终处于世界领先的地位^[4-8]。目前尚未发现利用免疫胶体金技术制备的免疫层析试纸检测蓖麻毒素的报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种检测蓖麻毒素的免疫层析试纸。

本发明所提供的检测蓖麻毒素的免疫层析试纸，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫的包被有抗蓖麻毒素A链蛋白抗体的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上的含有抗蓖麻毒素B链蛋白抗体的免疫金胶体探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫的样品垫。

为了使用更加方便，所述吸水纸垫的下面还紧密连接有背板，背板的材料优选的是塑料。

本发明的另一个目的是提供制备上述检测蓖麻毒素的免疫层析试纸的方法。本发明所提供的制备检测蓖麻毒素的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1.制备抗蓖麻毒素A链蛋白抗体，选取一株抗蓖麻毒素A链蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株免疫雌性Balb/C小鼠，一周后取腹水；将该抗体溶液喷到纤维膜上，室温晾干，然后将其粘贴在吸水纸垫上。

2.制备抗蓖麻毒素B链蛋白抗体：肌肉注射重组蓖麻毒素B链蛋白0.2mg+等体积福氏完全佐剂，一周后1mg蛋白+等体积福氏不完全佐剂加强免疫，4周后加强免疫蛋白1mg，3天后抽血。

3.制备抗蓖麻毒素B链蛋白抗体的免疫金胶体探针：

(1)将0.01％HAuCl₄水溶液，加热煮沸，每100ml HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.5ml的1％柠檬酸三钠水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

(2)确定最低偶联抗体浓度：调节胶体金溶液pH9.0，将抗蓖麻毒素B链蛋白抗体稀释2mg/mL，并依次加入到1ml胶体金溶液中100μl、90μl、80μl、70μl、60μl、50μl、40μl、30μl、20μl、10μl、0μl，混匀后于室温下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混匀，静置，10-20min后观察液体颜色，胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，为稳定1ml胶体金溶液所需最低偶联抗体量；

(3)将终浓度为0.08mg/mL上述最低偶联抗体量的抗蓖麻毒素B链蛋白抗体加入到50ml胶体金溶液中，混匀后得到抗蓖麻毒素B链蛋白抗体的免疫胶体金探针溶液。

4.将玻璃纤维膜或树脂浸泡到上述免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，干燥后粘贴在步骤1得到的粘贴在吸水纸垫上的喷有抗蓖麻毒素A链蛋白抗体的纤维膜上；

5.在步骤4中的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测蓖麻毒素的免疫层析试纸。

为了使用更加方便，所述吸水纸垫的下面还粘贴有背板。