[发明专利]披甲RNA及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种披甲RNA及其制备方法。

背景技术

RNA病毒性传染病具有普遍性、适应性、恶毒性、顽固性和难预防性等特点，常使数以千万的人丧失生命，经济损失巨大。上世纪50年代的流感大流行，2003年SARS引发的严重疫情，这些突发性的公共卫生事件每发生一次，都会对经济和社会稳定带来严重的负面影响。世界卫生组织称，禽流感对亚洲的威胁可能比非典更严重。在病毒检测和基因的表达研究中，常需要RT-PCR来进行定量或定性，这就需要RNA质控品和标准品。

为了更好对传染性疾病进行监控，各个国家甚至全球范围内相继建立了各种网络实验室，并成为一种发展趋势，一些高危险性的RNA病毒传染病的检测工作也逐渐在地方实验室开展。网络实验室需实行统一的检测标准和程序，因此也需要RNA质控品和标准品来对检测的整个过程包括RNA的提取和RT-PCR等进行质量控制。

流感病毒的高度变异性导致流行性感冒每年不同规模的小流行和若干年一次世界范围的大流行。甲型流感病毒广泛存在禽类和哺乳动物中，也是目前致人类和各种动物流感的主型，在人类和动物间流行时可导致高发病率和高死亡率(Potter CW.A History of infuenza [J].JAppl Microbiol，2001，91：572-9.)。人禽流感是由甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的急性呼吸道传染病，发病后死亡率高于60％。近年来人感染高致病性禽流感时有发生和流行，使得世界范围内都加大了流感的检测力度，流感/人禽流感网络监测实验室也应运而生。某些地方区县也设立监测点，开展流感的分子生物学检测工作。网络实验室需要进行统一的培训和考核，检测操作需使用统一的程序性文件，使用病原体颗粒或细胞作为标准品和质控品，具有传染的危险性，2005年美国病理学家协会误将含有H2N2病毒的能力验证样品向18个国家中的3747个参与实验室常规发送，后一经发现H2N2病毒，参与能力验证的所有实验室紧急销毁了含有H2N2病毒的样本(http://www.who.int/csr/disease/influenza/h2n2_2005_04_12/zh/index.html)。另外区县级监测点不具有分离培养流感病毒的能力，那么在运送过程中也存在着样品稳定性和生物安全问题，而通常裸露的RNA标准品和质控品不够稳定，这就需要无生物传染危险性和高稳定性的RNA标准品。

披甲RNA(armored RNA)是通过MS2包膜蛋白将目的RNA包裹起来，可耐受DNase和RNase，且没有生物传染危险性的噬菌体样颗粒。MS2/R17(血清I型)噬菌体是二十面体结构，属于正极性单链RNA球形病毒，其RNA因包膜蛋白的保护可以耐受DNase和RNase。MS2噬菌体结构上是由180个包膜蛋白分子、一分子的成熟酶蛋白及包裹着的一分子正链RNA基因组组成，基因组长3569nt。成熟酶蛋白具有保护噬菌体RNA免受核酸酶降解的作用，同时也是大肠杆菌F菌毛的受体。裂解酶蛋白具有裂解大肠杆菌细胞从而释放噬菌体粒子的作用。复制酶和三个大肠杆菌的蛋白形成蛋白质复合体负责噬菌体RNA的复制。包膜蛋白具有表达调控的功能，包膜蛋白二聚体可识别并结合到一个包含有复制酶启动子的茎环序列上，从而可以有效的抑制复制酶的表达(Ni CZ，et al.Structure 1995，3(3)：255-63)。包膜蛋白与此RNA茎环序列组成的RNA-蛋白质复合体通常被认为是引发噬菌体特异性RNA包裹的信号，RNA茎环序列称为packaging位点(即pac位点)，该pac位点同时是复制酶操纵子的一部分。RNA茎环序列为21nt或19nt，并且只有其中几个碱基是非常关键的(Stockley PG.Nucleic Acids Research，1995，23(13)：2512-8)。Pickett GG等(PickettGG Nucleic Acids Research，1993，21(19)：4621-6.)提出其他序列对噬菌体RNA的特异性包裹或许不是必需的。并试图通过实验证明这个pac位点能否在体外介导MS2包膜蛋白对异源性RNA的包裹，选用两个质粒转染同一个细胞，一个质粒表达MS2包膜蛋白，另一个表达含有pac位点的lacZ基因，但由于属于两套表达系统，MS2包膜蛋白的表达和lacZ基因的转录没有一个共同的阻遏调控系统，二者的比例无法有效调控，因而实验中MS2包膜蛋白包裹lacZ基因RNA的效率非常低，并没有得到预期的结果。