[发明专利]菊芋凝集素在制备治疗便秘和延缓胃肠老化药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种来自菊芋Helianthus tuberosus L.块茎的糖结合蛋白，其具有体外促进家兔离体回肠蠕动活性，具体地说是菊芋凝集素在制备治疗便秘和延缓胃肠老化药物中的应用。

背景技术

菊芋(Helianthus tuberosus L.)俗称洋姜、鬼子姜，原产于北美洲，系属菊科(Compositae)向日葵属的多年生草本植物(能形成地下块茎的栽培种)。菊芋是一个比较好的防风固沙、防止水土流失并具有一定开发利用价值的植物种。其超强的繁殖能力以及在刻苦环境中生存的特性都归功于它发达的根系和含有诸多成分的块茎。

人们发现用牛羊在食用菊芋块茎后，会出现腹泻的症状，严重者还会死亡。本专利首次通过实验发现向不同浓度的菊芋粗提物对回肠的蠕动都有刺激作用。粗提物经过蛋白酶的酶解后，其蛋白质片断增强了刺激作用。这种强烈的刺激作用很可能影响回肠的正常蠕动，造成牛羊的腹泻，严重时还可能造成回肠痉挛，使牛羊死亡。

发明内容

本发明提供一种来自菊芋Helianthus tuberosus L.块茎的具有体外促进家兔离体回肠蠕动活性的糖结合蛋白。

具体地说是菊芋凝集素在制备治疗便秘和延缓胃肠老化药物中的应用。

所述的菊芋凝集素可参照文献1(文献1.Characterization and molecularcloning of the lectin from Helianthus tuberosus，E.J.M.Van Damme，AnnickBarrel，Anne-Marie Mazard1，Peter Verhaert，Alistair Horman，Henri Debray，Pierre Rougel and Willy J.Peumans，Eur.J.Biochem.1999，259，135-142)分离纯化。其N末端为TVVTSLTFQTNKKVYGPFGT。SDS-PAGE鉴定纯度大于95％，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-MS)测定此活性蛋白的分子量为15.4KDa。

所述的糖结合蛋白，其可按如下方法制备获得：在3-5℃时，将200克菊芋新鲜块茎用100毫升0.01M Tris-HCl，0.15M NaCl缓冲液，pH 7.4，抽提。静置过夜后，80％硫铵沉淀，所得粗蛋白对二次水透析后冻干得粉末。首先采用阴离子交换柱Sephacel-DEAE，柱温为室温，检测波长为280nm，流动相为0.01M Tris-HCl无盐溶液到0.01M Tris-HCl，1M NaCl线形梯度洗脱。洗脱液对二次水透析后冻干。将冻干粉溶于0.01M Tris-HCl，0.15MNaCl缓冲液，pH 7.4，10毫升该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200(1.8×98cm)上，流动相为0.01M Tris-HCl，0.15M NaCl缓冲液，柱温为室瀣，检测波长为280nm，检测洗脱峰的体外刺激回肠蠕动的活性，将具有体外刺激回肠蠕动活性的洗脱成份冻干燥，制得20毫克该糖结合蛋白。最后用高效液相Hypersil C18柱，流动相为：10％乙腈-水溶液，检测波长205nm，柱温为室温，进样体积20μl，采用梯度洗脱，按时间收集。

经SDS聚丙酰胺凝胶电泳检测，糖结合蛋白分子量约为17000道尔顿。基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-MS)测定此活性蛋白的分子量为15376道尔顿。

所述菊芋凝集素可与充填剂形成的各种形式的散剂，颗粒剂，片剂，胶囊，水溶液，悬浮液，乳化液，喷剂或粉剂，药物可为口服药物。所述药物可以添加到各种食品当中，作为预防便秘和延缓胃肠衰老的保健食品，食品的形态可以是液体的比如像清凉饮料，乳酸饮料，调味品，汤类，或固体的奶酪，火腿，点心等。

本发明应用现代生物技术对菊芋块茎粗蛋白进行分离纯化，对纯化得到的蛋白质进行家兔离体回肠蠕动的活性筛选。结果表明该蛋白具有很好的刺激回肠蠕动的活性。因此，可将此蛋白或者其衍生物作为治疗便秘患者的药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。

附图说明

图1为蛋白粗提物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

图2为纯化蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

图3为回肠在加样前后的收缩振幅变化；

图4为不同浓度下回肠在加样前后的收缩振幅变化；

图5为胃蛋白酶加酶前后回肠平滑肌收缩的振幅变化；

图6为胃蛋白酶消化后，回肠平滑肌收缩的振幅变化；

图7为胰蛋白酶加酶前后回肠平滑肌收缩的振幅变化；