[发明专利]一种捕获分泌序列的载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种捕获分泌序列的载体及其构建方法和应用。

背景技术

蛋白质为所有生命体系赖以存在的基本支撑之一。在各种细胞蛋白中，分泌型蛋白(包括细胞膜导向性蛋白和周质腔蛋白)为一重要类别。这些蛋白通常在其一级结构中含有能够被细胞分泌因子识别的信号，例如经典的I型分泌蛋白，尤其是经由Sec途径而分泌的蛋白，通常在其N端含有一个由20-35个氨基酸组成的信号肽，该信号肽对于其所率引的蛋白的成功跨膜运输以及功能性构像的形成具有决定性作用。基于其独特的结构与作用特点，在原核生物中分泌型蛋白通常具有重要生物学功能，例如对环境信号的感知与传导，与宿主细胞相互作用，群体密度感应等，这些独特功能使得分泌型蛋白在病原微生物疾病防治中常作为药物和疫苗靶点，因而分泌蛋白的系统性筛选对于研究细菌的生命机制、致病机理、病害防治等具有重要意义。

琼胶酶是一种天然糖苷水解酶，多由海洋微生物产生，其作用底物为琼胶，能够裂解琼胶中的1，3β-D-或1，4α-L-galacto-pyranose连接。虽然近年来各种新型产琼胶酶菌株不断被发现，琼胶酶基因及蛋白的研究也日渐深入，然而真正成功应用于工业或科研领域的琼胶酶却极少。目前琼胶酶的实际性应用主要限于从琼胶包埋剂中回收DNA或其它分子，其潜在性应用包括用于制备琼胶衍生寡聚糖等，但将琼胶酶基因作为一种分子生物学工具进行应用的研究尚未见报道。

琼胶酶agaV为保守性I类分泌蛋白，具有典型的Sec-translocon依赖型分泌蛋白结构特征以及高效的胞间质折叠能力，并且其胞外活性检测简单直接，然而，迄今为止国际上尚未有利用琼胶酶基因捕获分泌信号的报道。

发明内容

本发明目的在于一种简单高效的捕获分泌蛋白基因序列的载体及其构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：载体为：具有序列表SEQ IDNo：2中碱基序列，含有去信号序列的琼胶酶基因agaV，外源基因插入位点以及筛选标记。

构建方法：

1)设计质粒pBK：

a.以质粒pACYC177为模板，用分别含有BamHI位点和HincII位点的卡那霉素基因引物，PCR扩增卡那霉素基因，PCR产物纯化后用限制性内切酶BamHI和HincII双酶切；

其中：PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，45℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min；

b.将质粒pBR322用BamHI和ScaI酶切，电泳回收3471 bp DNA片段，将该片段与a步骤中得到酶切处理过的PCR产物连接，连接液转化大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素LB培养基中过夜培养，筛选出抗卡那霉素的转化子，从转化子中提取重组质粒，即为pBK；

2)设计质粒pUALS：

a.将agaV的操纵子克隆到质粒pUC19，构成重组质粒pBUA1，而后以质粒pBUA1为模板，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物，进行PCR扩增，得到去信号序列的agaV的PCR产物，将PCR产物纯化，而后与载体pBS-T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5α，在含有100ug/ml Ap、40ug/ml Xgal和24ug/ml IPTG的LB固体培养基上培养筛选白色转化子；

其中：PCR条件：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，46℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，59℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min；

b.从挑取的白色转化子中提取重组质粒，即为pUALS；

3)设计分泌序列捕获载体：

a.将步骤1)中得到的质粒pBK用限制性内切酶BamHI和BsaBI酶切，得到3.2kbDNA片段；将步骤2)中的质粒pUALS用限制性内切酶BamHI和Sma I双酶切，得到1.3kb DNA片段，将其与前3.2kb DNA片段相连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Kn的LB固体培养基上筛选抗卡那霉素的转化子；

b.从抗卡那霉素的转化子中提取重组质粒，即为分泌序列捕获载体pBU。

所述步骤1)a中的引物为KnF2  5’-ATGGATCCACGGTTGATGAGAGC-3’，KnR3  5’-GCCGTCGACCAATTAACCAATTC-3’。