[发明专利]一种捕获分泌序列的载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种捕获分泌序列的载体，其特征在于：具有序列表SEQ ID No：2中碱基序列，含有去信号序列的琼胶酶基因agaV，外源基因插入位点以及筛选标记。

2.一种按权利要求1所述的分泌序列捕获载体的构建方法，其特征在于：

1)设计质粒pBK：

a.以质粒pACYC177为模板，用分别含有BamHI位点和HincII位点的卡那霉素基因引物，PCR扩增卡那霉素基因，PCR产物纯化后用限制性内切酶BamHI和HincII双酶切；

其中：PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，45℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，58℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min；

b.将质粒pBR322用BamHI和ScaI酶切，电泳回收3471bp DNA片段，将该片段与a步骤中得到酶切处理过的PCR产物连接，连接液转化大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素LB培养基中过夜培养，筛选出抗卡那霉素的转化子，从转化子中提取重组质粒，即为pBK；

2)设计质粒pUALS：

a.将agaV的操纵子克隆到质粒pUC19，构成重组质粒pBUA1，而后以质粒pBUA1为模板，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物，进行PCR扩增，得到去信号序列的agaV的PCR产物，将PCR产物纯化，而后与载体pBS-T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5α，在含有100ug/ml Ap、40ug/ml Xga l和24ug/ml IPTG的LB固体培养基上培养筛选白色转化子；

其中：PCR条件：94℃ 60s预变性模板DNA，然后94℃ 40s，46℃ 60s，72℃ 60s，5个循环后改为94℃ 40s，59℃ 60s，72℃ 60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min；

b.从挑取的白色转化子中提取重组质粒，即为pUALS；

3)设计分泌序列捕获载体：

a.将步骤1)中得到的质粒pBK用限制性内切酶BamHI和BsaBI酶切，得到3.2kbDNA片段；将步骤2)中的质粒pUALS用限制性内切酶BamHI和SmaI双酶切，得到1.3kb DNA片段，将其与前3.2kb DNA片段相连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Kn的LB固体培养基上筛选抗卡那霉素的转化子；

b.从抗卡那霉素的转化子中提取重组质粒，即为分泌序列捕获载体pBU。

3.按权利要求2所述的分泌序列捕获载体及其构建方法，其特征在于：所述步骤1)a中的引物为KnF2 5’-ATGGATCCACGGTTGATGAGAGC-3’，KnR35’-GCCGTCGACCAATTAACCAATTC-3’。

4.按权利要求2所述的分泌序列捕获载体及其构建方法，其特征在于：所述步骤2)a中的引物为UAF5 5’-ATGGATCCGAAGACTGGCGAGAAATC-3’UAR35’-CACTCGAGTTGATAAATTTCAATCGC-3’。

5.按权利要求2所述的分泌序列捕获载体及其构建方法，其特征在于：所述步骤2)得到去信号序列的agaV的PCR产物纯化后，与载体pBS-T于室温连接2-4小时。

6.一种按权利要求1所述的分泌序列捕获载体的应用，其特征在于：所述载体可捕获原核生物中分泌蛋白基因。