[发明专利]一种严格缺氧靶向载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和药学领域。具体地讲涉及一种严格缺氧靶向载体及其应用。

背景技术

临床研究表明，缺氧可引起多种心脑血管疾病。研究表明，恶性肿瘤内存在乏氧细胞。临床上已有许多证据表明，肿瘤乏氧细胞的存在不仅使肿瘤对放化疗的抗拒性增加，而且使肿瘤更具有侵袭性，容易发生远处转移。在乏氧条件下，细胞核产生缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)蛋白水平升高，与靶基因的结合活性增加，促进其转录，引起一系列细胞对缺氧的反应。现已发现的HIF靶基因有60多种，它们都具有缺氧反应元件(hypoxiaresponsive element，HRE)。HRE由HIF1结合点(共有序列为5’TACGTGCT 3’)和两侧的功能序列构成。HIF1结合点突变导致基因对缺氧的转录反应丧失。因此，可以利用缺氧反应元件作为启动表达的控制元件。Shibata等从血管内皮生长因子基因的5’端非翻译区序列中克隆了HRE，在低氧诱导下，它与CMV启动子共同调控的荧光素酶基因表达上升500倍。氧依赖性降解区域(oxygen-dependentdegradation domain，ODD)是HIF1上控制其稳定的关键区域。在常氧条件下，氧依赖的HIF1多聚羟化酶羟化ODD区Pro 564，使得肿瘤抑制基因产物(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product，pVHL)与HIF1亚基结合，激活pVHL介导的泛素-蛋白酶途径，最终使其被蛋白酶降解，故蛋白半衰期小于5min；而在缺氧条件下，由于缺少氧原子(必需来自氧分子)而使得HIF1多聚羟化酶羟化失活，以上的反应过程被阻断，蛋白可稳定存在。

本发明的目的，在于制备一种新型真核载体，在其启动子上游建入HRE，控制下游基因在缺氧条件下表达，在效应基因前融入ODD，使表达的蛋白在缺氧条件下稳定，在常氧条件下降解，以期达到严格缺氧靶向控制的作用，为提高药物到缺氧病灶的靶向性，更好发挥治疗作用。

发明内容：

在一方面，本发明提供一种新型真核基因构建体，在其启动子上游插入HRE，在效应基因前插入ODD，从而使该基因构建体具有严格缺氧靶向性。

满足这一要求的HRE可以是血管内皮生长因子基因、红细胞生成素基因来源的，可以是其单拷贝、可以是多拷贝，其序列可以为：TACGTGCT(SEQ ID NO：1)。

本发明的ODD优选具有序列：

ATGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCAAGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAG(SEQ IDNO：2)或其功能性片段，

翻译后的氨基酸序列为：

MNPFSTQDTDLDLEMLAPYIPMDDDFQLRSFDQLSPLESSSASPESASPQSTVTVFQ(SEQ ID NO：3)。

本发明基因构建体中的效应基因可以是EGFP或P53基因。

另一方面，本发明提供了含有上述基因构建体的表达载体。

还在另一方面，本发明提供了所述的基因构建体在制备用于治疗缺氧性疾病如肿瘤、心血管病的药物中的用途。还涉及含有上述基因构建体的药物组合物，其为适于进行静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水内注射的剂型。

附图说明：

图1：pVAX-HRE-ODD构建示意图；

图2：pVAX-HRE经Sma I和Bgl II双酶切鉴定，其中M：DNA Marker，分别为100，200，300，400，500，600bp；

图3：pVAX-HRE-ODD经Hind III和BamH I双酶切鉴定，其中M：DNA Marker，分别为100，200，300，400，500，600bp；HD：pVAX-HRE-ODD；

图4：pVAX-HRE-ODD-EGFP经BamH I和Not I双酶切鉴定，其中标签1，pVAX-EGFP；2，pVAX-HRE-EGFP；3，pVAX-HRE-ODD-EGFP；M，DNA Marker分别为500，1000，2000，3500，5500，7000bp；