[发明专利]一种大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及从红茶提取物中大批量分离制备高纯度茶黄素单体的方法。

技术背景

茶黄素(Theaflavins，TFs)是红茶中特有的一类多酚类聚合物，它们是在红茶的发酵过程中由一对合适的儿茶素氧化聚合而成的。茶黄素在红茶中的含量很低，大约占干重的2％左右，但是，它们对红茶的色泽和口感有很重要的影响。近年来的研究表明，茶黄素不仅对红茶的品质有着很大的影响，更重要的是它具有多种与人类健康密切相关的生物活性，如抗心血管疾病、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用等。目前在红茶中发现的茶黄素成分有十几种，其中主要的有以下四种：茶黄素(TF)、茶黄素-3-单没食子酸酯(TF-3-MG)、茶黄素-3’-单没食子酸酯(TF-3’-MG)和茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(TFDG)。其中茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-MG)和茶黄素-3’-没食子酸酯(TF-3’-MG)是两种同分异构体。其结构如式1所示。

式1

Theaflavin R＝R′＝H

Theaflavin-3-O-gallate R＝gallate，R′＝H

Theaflavin-3′-O-gallate R′＝gallate，R＝H

Theaflavin-3，3′-di-O-gallate R＝R′＝gallate

A：茶黄素(theaflavin，TF)

B：茶黄素-3-单没食子酸酯(theaflavin—3—O-monogallate，TF-3-MG)

C：茶黄素-3’-单没食子酸酯(theaflavin—3’—O-monogallate，TF-3’-MG)

D：茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(theaflavin—3，3’—O-digallate，TFDG)

对茶黄素单体成分的药理活性的深入研究对茶黄素的分离制备方法提出了更高的要求，其中优以TF-3-MG和TF-3’-MG的分离最为困难，目前还未见有特效的分离方法报道。文献报道的茶黄素的分离制备方法主要有两种，即SephadexLH-20凝胶柱层析法或高速逆流色谱法。就这两种方法而言，凝胶柱层析法制备量较大，但所需时间较长，溶剂消耗量大；而高速逆流色谱法分离效率较高，但制备量不及柱层析。目前文献中报道的这两种方法主要是用于小制备量分离(几百毫克上样量)。对于上述四种主要的茶黄素而言，总的来说，TF和TFDG比较容易与其它茶黄素成分分离，而两种TF—MG之间的分离一直以来具有很大的挑战性，单纯使用上述任何一种方法都只能实现其部分分离。在以大量制备分离为目的时，随着上样量的增大，两者的分离选择性更差，纯化难度更大。因此，高纯度茶黄素单体的大制备量分离一直以来具有较大困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种从茶黄素粗提物中分离制备了十克至几十克高纯度的茶黄素单体的方法，该方法制备量大，产物纯度高，时间短，溶剂消耗量少。

为达到上述目的，本发明采用的分离方法及步骤如下：

1、首先根据拟装填的柱床高度和直径，计算称取一定量的凝胶柱填料，用洗脱液进行溶胀。采用湿法装柱，装好的凝胶柱应均匀、无气泡。本方法中的凝胶填料优选Sephadex LH-20；洗脱液可以采用无水乙醇、50—95％乙醇水溶液或30—70％的丙酮水溶液。

2、取一定量的红茶粗提物，用洗脱液溶解后上样。根据上样后凝胶柱上的颜色段，分段收集。将所收集的的流分经HPLC检测后，将其中只含有TF的第一段F0以及只含有TFDG的最后一段Fn+1分别收集，浓缩干燥后再用凝胶柱层析和高速逆流色谱纯化。而含有TF—3—MG和TF—3‘—MG的中间色段根据其中TF—3—MG和TF—3‘—MG的相对含量的不同，分五个部分收集，分别为F1、F2、F3、F4、…Fn(按洗脱顺序先后排列)。重复上样多次，使F1、F2、F3、F4、…Fn得到富集，浓缩干燥。

其中，n的数量可根据实验需要作调整，n大时，分段更细，但后续工作量加大。

3、将由粗样分离所得的TF-3’-MG相对含量在50％以上的级分分别再上凝胶柱进行分离，将反复分离富集得到的TF-3’-MG相对含量在90％以上的级分用HSCCC进一步纯化，去除其中少量的TF-3-MG和其它杂质。