[发明专利]具有R－异构体立体选择性的酯水解酶及其基因和重组酶

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种具有R-异构体立体选择性的酯水解酶及其基因和重组酶，包括该酯水解酶基因的表达载体及制备其重组酶的方法及其基因工程菌株，以及该酯水解酶在立体选择性催化手性化合物(R型)合成中的应用。

背景技术

酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一类在手性合成中有着重要用途的生物催化剂。这些酶能识别很宽的底物，目前>40％的生物不对物合成反应可由酯水解酶催化完成，这些反应具有条件温和、反应的区域选择性和立体选择高等特点。在酶动力学拆分外消旋酯、胺和转化前手性醇等方面得到广泛的应用。另外，它们还可用于选择性酯化、转酯化和聚合反应中。

由于对手性药物和中间体需求的增长，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人们的重视和工业化应用。生物法合成手性化合物的关键问题在于寻找具有高度立体选择性催化功能的生物催化剂。由于酯水解酶具有广泛的用途，筛选新的酯水解酶正成为酶工程的研究热点。虽然酯水酶在微生物界分布很广，但它们的立体选择性催化能力不一样。在同一生物体内往往存在多种酯水解酶，由于它们之间立体选择性存在差异性，利用微生物细胞或它们的粗酶制品进行酶法合成手性化合物时往往会降低产物的光学纯度(Geun-Joong Kim，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 17，2002：29-38)。解决这一问题可以通过工程的调控手段来减少副反应的发生(PerBerglund，Biomolecular Engineering，18，2001：13-22)，也可以通过分离纯化得到单一的酶制剂来进行催化反应，但这些过程往往较复杂并具有高的成本，在生产中不易被采用。如果通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，就能够很方便达到以上的目的。

发明内容

本发明人即为了解决上述课题，通过筛选大量的微生物，发现芽孢杆菌属微生物能产生一种有高度R-异构体立体选择性的酯水解酶，可用于催化手性化合物的合成；为了提高这种酯水解酶的产量和消除野生型菌株中同工酶对酶催化反应的负面影响，本发明克隆了该基因并对此基因在大肠杆菌内进行表达。因此，本发明的目的之一是提供一种具有R-异构体立体选择性的酯水解酶及其基因和由此推断的氨基酸序列；目的之二是提供包括该酯水解酶基因的表达载体和利用该载体转化的重组微生物，如基因工程菌株；目的之三是提供从所述微生物制备重组酶的方法及由此制得的重组酶；目的之四是提供该重组酯水解酶在立体选择性催化手性化合物(R型)合成中的应用。

本发明具有R-异构体立体选择性的酯水解酶基因可得自芽孢杆菌属微生物，如Bacillus sp.ATCC 31195。本发明采用的技术方案是通过PCR扩增得到芽孢杆菌的一种具有R-异构体立体选择性的酯水解酶基因BSEST，测定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所示，其中，其编码序列(CDS)从DNA第1个碱基起至第753终止，ATG为转录起始密码子，TAA为转录终止密码；并得到相应的氨基酸序列，如序列表中SEQ ID No.2所示。当然，如本领域技术人员所知，本发明酯水解酶基因还可以是编码由序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它核苷酸序列；而本发明的酯水解酶不仅限是具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。

本发明的另一目的是提供包括上述酯水解酶基因核苷酸序列的表达载体。其是用常规方法将本发明的酯水解酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis.)，PQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen)，但不是仅限于这些载体。

较佳的是将用PCR扩增到的BSEST基因产物和克隆载体pMD18-T连接，形成克隆载体pBSEST-T。pBSEST-T和表达载体pET22b(+)分别用限制性内切酶消化，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成BSEST基因的表达载体(质粒)pBSEST-PET。