[发明专利]播娘蒿DsCBF基因及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种播娘蒿DsCBF抗寒基因及其制备方法；以及用于表达播娘蒿DsCBF基因的重组质粒及其在植物抗寒、抗旱和抗盐碱中的应用。

背景技术

低温是地球上植物产量和地域分布的主要限制因素之一，全球每年因为低温造成的农作物损失达到上千亿美元，这已经是世界范围内普遍存在和关注的问题。

为了提高经济植物的抗寒性，扩大其耕种面积，提高经济植物在胁迫环境下的生存能力和产量，人们对植物抗寒机制进行了大量的研究。CBF基因又称DREB1转录因子，其本身是作为植物响应寒冷胁迫的总开关存在的。植物体受到冷刺激时，CBF基因大量表达，从而调控其下属的多种冷响应蛋白表达，产生一系列的保护作用，以减少寒冷对植物的损伤。

传统的植物改良如杂交、诱变等方法费时、费力、没有针对性，克隆抗寒相关基因并利用转基因技术，通过基因工程培育高效抗胁迫品种将成为一条重要的途径。转基因表达CBF基因不仅可以使植物抗寒性提高，而且还能增强植物对盐碱等胁迫的抗性。

十字花科植物播娘蒿(Descurainia sophia)分布范围广泛，适应性极强，其天然蕴藏量较为丰富，且极其耐寒，可以耐受冬天-40℃的低温，在春天低于0℃的条件下亦能抽苔开花。此外对盐碱也有较大的耐受能力，对土壤水份的需求量也不高。播娘蒿种子具有极强的种子繁殖能力以及良好的发芽能力，在4℃温度下，其种子发芽率仍可达70％以上。经各方面的调查研究结果均表明，播娘蒿具有极强的适应恶劣环境生长的能力。因此，研究播娘蒿的对恶劣环境适应的相关原理和分子机制，有利于对其它抗逆性较弱的经济植株进行遗传改造和种植推广的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种播娘蒿新型DsCBF抗寒基因，以及该DsCBF抗寒基因的制备方法。

本发明的另一目的还提供一种用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，以及该DsCBF基因重组质粒的制备方法。

本发明的又一目的还提供制备的播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，在植物抗寒、抗旱和抗盐碱中的应用；以及在抗逆性较弱的经济植株进行遗传改造和种植推广方面的应用。

本发明的目的是由以下的技术方案来实现的。

本发明所述的播娘蒿DsCBF抗寒基因含有序列表SEQ ID NO：1中所述的核苷酸序列。此DsCBF抗寒基因由提取播娘蒿总RNA，对DsCBF基因进行全长克隆获得。

本发明所述的用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，所述的质粒含有上述所述的核苷酸序列。

本发明所述的播娘蒿DsCBF抗寒基因编码的蛋白，含有序列表SEQID NO：2中所述的氨基酸序列。

本发明所述的播娘蒿DsCBF抗寒基因的制备方法依次包含以下步骤：

(1)采用Trizol试剂(Gibco，NY，USA)提取播娘蒿总RNA；

(2)以总RNA为模板，进行RT-PCR(TaKaRa，Japan)扩增得到DsCBF基因的EST序列；

(3)采用RACE方法(ClonTech试剂盒，NY，USA)对DsCBF基因进行cDNA全长克隆获得。

本发明所述的用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒的制备方法，包含以下步骤：

(1)通过RT-PCR扩增得到播娘蒿DsCBF基因的开放阅读框；

(2)将上述播娘蒿DsCBF基因片段克隆至中间载体pMD18-T(TaKaRa，Japan)，然后进一步克隆至植物表达载体pBI121(ClonTech，NY，USA)；

(3)将带有播娘蒿DsCBF基因片段的表达载体pBIcbf转入根癌农杆菌中，通过农杆菌介导转染到模式植物的CBF缺陷型植株。

本发明所述的用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，在植物抗寒、抗旱和抗盐碱中的应用。

本发明所述的用于表达播娘蒿DsCBF抗寒基因的重组质粒，亦能在抗逆性较弱的经济植株进行遗传改造和种植推广方面的应用。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明播娘蒿DsCBF抗寒基因通过转基因表达CBF基因，用于转化模式植物的CBF缺陷型植株，从而使植物具有抗寒性、抗旱性和抗盐碱性。

附图说明

图1是含有DsCBF基因的重组质粒I的一种结构示意图，表达载体为pBIcbf。

具体实施方式

实施例1 播娘蒿DsCBF抗寒基因的制备

1、播娘蒿DsCBF抗寒基因克隆