[发明专利]包括含有嵌入性假核苷酸(IPN)的嵌入性核酸(INA)的扩增阻断剂

说明书

技术领域

本发明涉及检测核酸的检测法，并且具体地涉及使用DNA扩增阻断 剂的改善的检测法。本发明还涉及新型DNA扩增阻断剂，以及适用于特 异性和灵敏性检测核酸中的5-甲基胞嘧啶碱基的方法。

背景技术

目前有许多方法可以用于检测特异的核酸分子。这些方法典型地依赖 于目标核酸和核酸探针之间的序列-依赖性杂交，所述核酸探针在长度上 可以从短的核苷酸(20个碱基或更少)到几千个碱基(kb)的序列。

从一组核酸序列中扩增特异的序列最广泛应用的方法是聚合酶链式 反应(PCR)方法(Dieffenbach C和Dveksler G eds.PCR Primer：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在这种扩增方 法中，互补链长度通常为15-30个核苷酸并且在要扩增区域两端的寡核苷 酸，被用来在变性的单链DNA上起始DNA合成。使用热稳定性DNA聚 合酶，变性、引物杂交和DNA链合成的连续循环使得引物之间的序列进 行指数扩增。通过首先用反转录酶将RNA复制成DNA以产生cDNA拷 贝，可以扩增RNA序列。扩增的DNA片段可以通过许多方法检测，包 括凝胶电泳、印迹、标记探针杂交、使用允许后续鉴定的标记引物(例如 通过酶连接的检测)、使用当与靶点DNA杂交时产生信号的荧光-标记引 物(例如Beacon和TaqMan系统)。

除了PCR，已经开发了许多其它检测和扩增特异的核酸序列的技术。 一个实例是连接酶链式反应(Barany F Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991))。

对于直接检测，目标核酸最通常基于大小从凝胶电泳上分离，并且在 与同所述目标序列互补的探针杂交之前，转移到固体支持物上(DNA和 RNA印迹)。所述探针可以是天然核酸或类似物，诸如肽核酸(PNA)或锁 定核酸(LNA)。探针可以直接标记(例如用³²P)，或者可以使用间接的检 测。间接方法通常依赖于将“标记”诸如生物素或洋地黄毒苷结合到探针 中，并且然后通过诸如酶-连接底物转化或化学发光的方法检测所述探针。

另一种广泛应用的直接检测核酸的方法是“夹心式”杂交法。在这种 方法中，将捕获探针偶联到固体支持物上，并且在溶液中，将目标核酸与 结合的探针杂交。洗去未结合的目标核酸，并且使用与目标序列杂交的第 二探针检测结合的核酸。检测可以使用上文列出的直接或间接的方法。 “分支DNA”信号检测系统是应用夹心式杂交原理的实例(Urdea MS等. Branched DNA amplification multimers for the sensitive，direct detection of human hepatitis viruses.Nucleic Acids Symp Ser.1991；(24)：197-200)。

应用核酸杂交进行核酸序列的直接检测的快速发展领域是DNA微点 阵领域(Young RA Biomedical discovery with DNA arrays.Cell 102：9-15 (2000)；Watson A New tools.A new breed of high tech detectives.Science 289：850-854(2000))。在这一方法中，将可以从寡核苷酸到更长的序列如 cDNA克隆范围的单一核酸种类固定到格子模式的固体支持物上。然后， 将标志的或标记的核酸群体与点阵杂交，并且定量与点阵中每点杂交的水 平。尽管可以利用其它的检测系统，但是最常见地将放射活性-或荧光-标 记的核酸(例如cDNAs)用于杂交。