[其他]中国冬虫夏草真菌及其人工培养方法

说明书

中国冬虫夏草是一种珍贵的野生药用和食用菌类植物。本发明从野生天然虫草上采用组织培养和子囊孢子培养的不同方法，均获得了与天然虫草性状一样的虫草真菌。在无菌器皿中人工培养，能长出与天然虫草一样的子座及与天然完全一样的子囊孢子。从而证实分离到的是真正的中国冬虫夏草Ｃ．Ｓｉｎｅｎｓｉｓ真菌。人工虫草菌丝经药理药化对比试验与天然虫草基本一样，为人工培育和广泛应用提供了有效的方法。

本发明涉及中国冬虫夏草的人工培养问题。

中国冬虫夏草（Cordyceps Sinensis〔Berk〕Sacc），是一种名贵的野生药用和食用菌类植物。它的纯培养真菌从未被真正分离到。本发明得到的这一微生物新种的分生孢子世代分类上属：半知菌纲（Fungi Impergecti）从梗孢目（Moniliales），梗孢科（Monjliacean），头孢子菌属（Cephalosporium），定名为“冬虫夏草头孢菌”，学名：Cephalosporis Dongchongxiacae Sp.nev。该菌种现保藏在中国微生物菌种委员会普通微生物中心，保藏号为0020，保藏日期为1985·5·28。

冬虫夏草属（Cordyceps）在全世界已发现并鉴定的种有三百多个，对生长在青藏高原的中国冬虫夏草虽在一百多年前就被命名为C.Sinqnsis（Berk）Sacc，但其真菌因从未被真正分离到，使其分生子世代（无性世代）的分类地位一直没有得到解决。国内外的许多研究都把分离到的杂菌或冬虫夏草属的其它种，误认为是中国冬虫夏草真菌。本发明澄清了这一错误。

本发明的目的是在获得真正的中国冬虫夏草真菌的同时，提出了它的人工培养方法。

其菌种的分离有两种方法：

一是组织分离法采集未成熟的新鲜冬虫夏草（最好是子座还未长出地面的），洗净，用无菌水多次冲洗，放入0.1%升汞溶液中消毒5分钟，用灭菌蒸馏水洗去升汞，在无菌条件下，切去外皮，避开肠道，切取白净组织，剪碎，接于分离培养基表面，置于5～20℃温度条件下培养，此法简单易行，如材料不理想，培养温度不适宜或消毒不彻底，容易长出其它共生菌或互生菌。

一种是子囊孢子培养法：将尚未成熟的野生天然虫草移栽到有保护条件圃中，用消毒纸袋套在它的子座上，使弹出的子囊孢子附着在纸袋上，收取纸袋阴干，放在冰箱中备用。净化时将附有子囊孢子的纸袋浸于土壤浸出液中，浸透后用小刀将子囊孢子刮下，收集于离心管中，离心分离，弃去上部清液，用土壤浸出液反复洗涤，再用蔗糖溶液洗涤，反复离心分离，收集浮于液面的子囊孢子，再用土壤浸出液洗涤，放入冰箱中备用。萌发时取净化的子囊孢子少许，放入含庆大霉素的土壤浸出液中，室温培养三到六天，子囊孢子即可萌发，用灭菌吸管吸取已萌发的子囊孢子稀悬液，滴在琼脂平板上，在显微镜下挑取单个萌发孢子，接种在分离培养基上室温培养，此法麻烦，初生长缓慢，但可靠性高。

上述两种方法使用的分离培养基最好的配方是：葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克、硫酸镁0.5克、磷酸二氢钾1克、维生素液20毫升（其配方是：盐酸硫胺100毫克、核黄素25毫克、吡哆醇25毫克、矾酸钙100毫克、对安基苯甲酸25毫克、氯化胆碱100毫克、肌醇100毫克、烟酰胺100毫克、叶酸2.5毫克、生物素1毫克、蒸馏水500毫升混合而成。）、琼脂20克、蒸馏水1000毫升，最好再加20%虫草蝙蝠蛾幼虫（即虫草菌寄生体）浸出液（即将切碎干净的鲜幼虫1克与5毫升蒸馏水混合，浸泡8～12小时后过滤而成。）。

新鲜组织块在分离培养基上接种培养一周后，周围长出细小菌丝，两个月后形成菌落，三到四个月菌落直径可达1～2厘米。净化子囊孢子在分离培养基上接种培养10天后，孢子芽管伸长、分枝，形成菌丝，两个月菌落直径2～6毫米，三个月可见很短的灰白色气中菌丝，四个月菌落直径达1～2厘米，并有棕黑色色素扩散于培养基中。