[发明专利]基因表达量比较分析法

权利要求书

1、一种基因表达量比较分析法，其特征在于它具有如下特征：

(a)将不同来源的信使核糖核酸(mRNA)用适当的方法标记后，等量混合，作为聚合酶链反应(PCR)的底物；

(b)用与基因各来源相对应的引物和基因特异性引物进行PCR扩增；

(c)用生物发光分析法测定序列，以碱基种类代表基因的不同来源，信号强度代表各来源中基因表达量。

2、根据权利要求项1所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“不同来源的mRNA”是指同一基因在同一生物种的不同个体或同一基因在同一个体的不同器官，如健康人和病人某一器官中的mRNA；也可指同种个体中的同一基因在不同的化学或物理刺激下产生的表达。

3、根据权利要求项1所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“与各来源相对应的特异性引物”是指一组序列不同，但由相同种类和数目的碱基所组成的引物，每一种引物代表一种基因的来源。

4、根据权利要求项1所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“用适当的方法标记”是指用适当长度的DNA片段来区别各来源基因的方法，第一种方法：将不同来源的mRNA用反转录PCR(RT-PCR)法制成双链互补DNA(cDNA)后，用限制性内切酶将之切成适当长度的片段，用选择性适配器(adapter)与之相连接，不同来源的mRNA连有不同的adapter；第二种方法：将带有多聚胸腺嘧啶引物的微球分别与不同来源的mRNA杂交，并制成第一链cDNA，用5’端含有与各来源相对应序列的锚定引物进行互补链(第二链cDNA)的合成，锚定引物的5’端用于区别基因的不同来源；第三种方法：直接用5’端含有与各来源相对应序列的锚定引物与mRNA杂交，并制成第一链cDNA，锚定引物5’端的构造与第二种方法相同。

5、根据权利要求项4所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“选择性适配器”是指含有与权项4中限制性内切酶切口互补的序列，并在连接酶作用下能与切口完全连接的楔形双链DNA，其中一条链的5’端含有权项3中与各来源相对应的特异性序列，另一条链的3’端含有与上述链不互补的碱基，或3’端经过适当修饰不能在DNA聚合酶的作用下发生延伸反应。两条链组成“Y”型的结构，一端不互补，成叉型分开，另一端成权项4第一种方法中限制性酶切口的形状。

6、根据权利要求项4所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“选择性适配器”和“锚定引物”中用于区别基因不同来源的部分是指一段碱基种类和数目相同而排列顺序不同的序列，它们具有相同的熔解温度(Tm值)。

7、根据权利要求项1所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“生物发光分析法”是指定量测定延伸反应产生的焦磷酸盐(PPi)的方法。

8、根据权利要求项7所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“延伸反应”是指在权项1中的PCR扩增产物的单链产物中，加入特定的引物或引物混合物进行退火，然后按一定次序分别逐个加入三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，或三磷酸双脱氧核苷酸(ddNTP)，或它们的类似物，在DNA聚合酶的作用下，当所加dNTP或ddNTP或它们的类似物与模板互补时，所发生的聚合反应。

9、根据权利要求项8所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“单链产物”是指用物理或化学的方法将权项1中的PCR产物制成的单链产物，其中“物理学方法”指用生物素(biotin)标记PCR中的一种引物，然后用固相法制备单链，“化学方法”是指用酶切法制备单链。

10、根据权利要求项7所述的基因表达量比较分析法，其特征在于所述“延伸反应”指权项1中的PCR扩增产物，经酶处理去除PCR反应中的PPi，过剩的dNTPs和过剩的引物后，加入单链结合蛋白(如SSB)，其余按项8进行反应。