[发明专利]结核分枝杆菌诊断检测试剂

说明书

1.技术领域  本发明属医学免疫诊断学技术领域，具体是关于一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及其在临床结核病的诊断中的应用。

2.发明背景  结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病，曾在全球出现过大流行。随着有效的抗结核药物的问世，结核病流行情况出现好转。但是，近十余年来由于结核杆菌多重耐药性菌株的出现、HIV与结核杆菌伴发感染以及人口流动的增加等原因，结核病疫情再度回升，全球结核病形势出现了恶化趋势。1993年WHO宣布“结核病全球紧急状态”，1998年WHO又重申遏制结核病的行动刻不容缓。目前全世界约有20亿人受到结核杆菌感染，现有2000万结核病人，其中95％在发展中国家。每年新发病人数为800-1000万，死亡人数约300万，已超过艾滋病、疟疾、腹泻、热带病死亡人数的总和。我国的结核病流行情况也一直十分严重，是全球22个结核病高负担国家之一，根据2000年进行的第四次全国结核病流行病学抽样调查结果估算，我国约有450万活动性肺结核病人，结核病人数位居世界第二位，约占全球结核病人的四分之一，传染性肺结核病人约150万，每年约有12.7万人死于结核病。结核病已成为当今威胁人类健康的主要全球性疾病之一，也是由单一传染因子导致死亡的最常见原因。降低结核病死亡率的关键是早期诊断，从而能准确及时的制订合理、科学的治疗方案。

目前结核病诊断的主要手段有病原菌的涂片染色镜检和分离培养、结核菌素皮肤试验以及血清学检测等。涂片染色镜检法是基于结核杆菌的抗酸染色特性达到检定的目的，但该法存在灵敏度低、特异性差的缺点。分离培养法检查往往需4-8周或更长的时间，常延误临床的诊断和治疗。结核菌纯蛋白衍生物(PPD)是目前广泛应用于结核病诊断的试剂，但由于PPD中含有许多分枝杆菌属(包括致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和卡介苗)所共有的抗原分子，因此PPD诊断结核病的特异性差，不能准确区分PPD试验结果阳性究竟是因为接种卡介苗、与环境中多种非结核性分枝杆菌接触后造成的致敏还是真正的结核杆菌感染所致。血清学检测方法具有快速、简便、便于推广，无需特殊精密仪器的特点是一种非常有潜力的结核病诊断手段，但是当前所用的诊断抗原(如PPD、38KD、30KD、14KD、19KD蛋白等)存在着特异性较差、假阳性率高的缺点，急需一种具有较强特异性及免疫原性的诊断抗原。

结核分枝杆菌ESAT-6作为一种低分子量分泌性抗原蛋白，在结核杆菌感染早期即由细菌分泌产生，并被宿主免疫系统识别。结核杆菌ESAT-6抗原蛋白分子表位众多(有B细胞表位、CD₄⁺、CD₈⁺T细胞表位以及DTH表位)，且仅在致病性分枝杆菌中表达，而不存在于卡介苗及其它非致病性分枝杆菌中，因而是一种极有前景的结核病特异诊断抗原。CFP-10也是一种分泌性抗原，编码CFP-10的基因与ESAT-6相邻，处于同一操纵子中，均位于结核分枝杆菌基因组的RD1区段，在卡介苗中同样缺失。联用ESAT-6与CFP-10诊断结核菌感染，能提高检测的敏感性和特异性。

3.发明内容  本发明通过基因工程手段，将结核分枝杆菌ESAT-6和CFP-10蛋白在体外表达、纯化、并制备结核分枝杆菌的抗体及抗原检测试剂盒；以及将ESAT-6和CFP-10融合表达所产生的融合蛋白经纯化后，制备结核分枝杆菌的抗体及抗原检测试剂盒。该试剂盒能特异性地检测结核分枝杆菌的抗体及抗原，能区分是因为接种卡介苗、以及与环境中多种非结核性分枝杆菌接触后造成的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染，可用于结核病的临床血清学诊断。

4.具体实施方式1)以结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，分别设计ESAT-6和CFP-10基因的引物，克  隆ESAT-6和CFP-10基因。2)通过基因工程手段，将克隆的ESAT-6和CFP-10基因末端加上连接肽段，获得融合蛋白  基因。3)将各克隆基因转入表达载体，表达相应蛋白，通过凝胶电泳及Western Blotting进行鉴  定分析。4)采用标准的蛋白分离纯化技术，纯化各表达蛋白。如：离心、离子交换层析、疏水层析、  亲和层析等。5)各表达蛋白采用标准的免疫程序免疫动物，如：家兔、豚鼠、山羊等。制备二种相应的  抗体，并纯化其IgG。6)经方阵滴定，确定包被抗原(检测蛋白)的浓度，并配备其他相关试剂，制备结核分枝  杆菌抗体ELISA检测(间接法)试剂盒。7)经方阵滴定，确定包被抗体(检测蛋白抗体)、第二抗体(酶标检测蛋白抗体)的浓度，  并配备其他相关试剂，制备结核分枝杆菌抗原ELISA检测(双抗体夹心法)试剂盒。

实施例实施例1：ELISA间接法检测结核分枝杆菌抗体取待检血清样品0.1ml，加入已包被有融合蛋白抗原的酶标板中，37℃孵育30分钟，每块板设三孔阴性对照，二孔阳性对照，一孔空白对照。孵育结束，弃去板孔中的液体，用洗涤液洗板五次，扣干。加入抗人IgG酶标抗体，充分混匀，37℃孵育30分钟。同上洗板后，加入显色液0.1ml，轻拍混匀，37℃避光显色30分钟。每孔加入终止液一滴，轻拍混匀，用450nm波长酶标仪测读OD值，判定结果。实施例2：ELISA双抗体夹心法检测结核分枝杆菌抗原取待检血清样品0.1ml，加入已包被有融合蛋白抗体(第一抗体)的酶标板中，37℃孵育30分钟，每块板设三孔阴性对照，二孔阳性对照，一孔空白对照。孵育结束，弃去板孔中的液体，用洗涤液洗板五次，扣干。加入第二抗体(兔抗融合蛋白抗体)，充分混匀，37℃孵育30分钟。同上洗板后加入抗兔IgG酶标抗体，充分混匀，37℃孵育30分钟。洗板，加入显色液0.1ml，轻拍混匀，37℃避光显色30分钟。每孔加入终止液一滴，轻拍混匀，用450nm波长酶标仪测读OD值，判定结果。