[发明专利]生产L－谷氨酸、L－脯氨酸或L－精氨酸的细菌和方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工业领域。具体而言，本发明涉及通过发酵生产L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法，和该方法中使用的细菌。L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸在食品、医药等领域有重要用途。

背景技术

L-精氨酸和L-脯氨酸通过大肠杆菌由共同前体L-谷氨酸合成。因此，L-精氨酸或L-脯氨酸的生产水平取决于其共同前体L-谷氨酸的利用度。

已知有L-谷氨酸合成水平增加的大肠杆菌菌株。具体而言，由大肠杆菌K12菌株衍生的2-酮戊二酸脱氢酶活性缺乏或降低菌株可以较高的产率生产L-谷氨酸(美国专利5,393,671和5,908,768)。

也已知某些大肠杆菌突变体可以产生L-精氨酸和L-脯氨酸。它们是作为对这些氨基酸有抗性的突变体通过克隆一些对它们的生物合成重要的基因获得的(英国专利2080825A)。

发明概述

本发明的目的是提供具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的新细菌和使用具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的细菌生产L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法。

发明人发现ilvA基因缺陷的大肠杆菌L-异亮氨酸营养缺陷型产生L-谷氨酸。此外，ilvA基因缺陷的菌株可以用作培育L-脯氨酸和L-精氨酸的亲本菌株。换而言之，发明人发现L-异亮氨酸营养缺陷型可用来改进L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的生产者。至此，完成了本发明。

本发明提供：

(1)具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的L-异亮氨酸营养缺陷型埃希氏菌属细菌。

(2)根据(1)的埃希氏菌属细菌，其任一种L-异亮氨酸生物合成酶活性缺陷。

(3)根据(2)的埃希氏菌属细菌，其苏氨酸脱氨酶活性缺陷。

(4)根据(1)到(3)任一项的埃希氏菌属细菌，其为大肠杆菌。

(5)生产L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的方法，包括在含有L-异亮氨酸的培养基中培养(1)到(4)中任一项限定的埃希氏菌属细菌，以在培养物中产生和积累L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，并由培养物中收集L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸。

发明详述

(1)本发明的细菌

本发明的细菌是属于埃希氏菌属的细菌，它为L-异亮氨酸营养缺陷型并具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的能力。埃希氏菌属细菌的一个实例是大肠杆菌。

“具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的细菌”是指该细菌在培养基中培养时在培养基中积累相当量的L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，或增加细菌中的L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸含量。“L-异亮氨酸营养缺陷型细菌”是指该细菌在培养基中生长需要L-异亮氨酸(通常不低于10mg/l)。

本发明的细菌至少产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸，也可能产生两种或更多的L-氨基酸。

本发明的细菌可以通过向具有产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸能力的埃希氏菌属细菌赋予L-异亮氨酸营养缺陷型或者向L-异亮氨酸营养缺陷型埃希氏菌属细菌赋予产生L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-精氨酸的能力而获得。

为了赋予L-异亮氨酸营养缺陷型，可以使用包括以下步骤的方法：诱变埃希氏菌属细菌，让埃希氏菌属细菌在含有L-异亮氨酸的琼脂培养基上形成菌落，影印该菌落至不含L-异亮氨酸的琼脂培养基中，选择在不含L-异亮氨酸的琼脂培养基上不能生长的菌株。诱变包括UV辐射和使用常用于诱变处理的诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理。或者，可以选择天然存在的突变体。

异亮氨酸营养缺陷型优选是由于任何L-异亮氨酸生物合成酶活性(催化L-异亮氨酸生物合成的酶活性)的缺陷引起。L-异亮氨酸生物合成酶包括苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸同分异构还原酶、二羟酸脱水酶。优选苏氨酸脱氨酶活性缺陷。“活性缺陷”一般是指酶的细胞内活性低于野生型菌株的酶活性，当通过使用基因重组技术等修饰使得酶活性缺陷的菌株时，该酶的细胞内活性低于修饰前该菌株的酶活性。

为了获得上述酶活性缺陷，引起酶活性缺陷的突变可以通过常规诱变技术或基因过程技术导入至编码该酶的基因。

诱变技术的实例包括例如使用X射线或紫外光辐射的方法、使用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍等诱变剂处理的方法。引入突变的基因位点可以是编码酶蛋白的编码区或启动子等表达调节序列。