[发明专利]一种重组人肝细胞生长因子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的生产工艺。该工艺是通过基因工程和蛋白质工程技术相结合，从而实现原核表达体系表达产生真核基因产物的一种新方法，应用该工艺可以大量制备rhHGF。

发明背景

肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)是由674个氨基酸组成的异二聚体蛋白质，分子量为80KD，在动物和人体内，HGF首先被翻译成一条由728个氨基酸组成的无生物活性的前体(pre-pro-HGF)，然后通过翻译后加工系统切掉N端52个氨基酸，并将肽链从494位精氨酸后切开；成熟的活性HGF蛋白由一条含440个氨基酸的重链和一条含234个氨基酸的轻链在空间盘曲折绕而成。HGF广泛存在于肝脏及肝外多种组织中，作为一个多功能蛋白质，它可以促进肝细胞及多种内皮细胞、上皮细胞的分裂、分化及形态发生，参与肝脏及其他重要组织器官损伤后的修复和生理条件下死亡细胞的再生；HGF还具有明显的抑制肝癌等肿瘤细胞增殖，并使肿瘤细胞再分化成正常细胞的重要生理功能。目前，HGF的生物学特性、生理作用及作用机制方面的研究已取得了较大的进展。随着研究的深入，特别是临床药用研究的开展，对HGF的需求量日益增加，但HGF的来源问题尚未解决。以往使用的HGF均从含量极微的组织中提取，过程复杂，成本昂贵，很难适应HGF研究和开发的需要。寻找并建立一个体外大量获得HGF的方法和途径是国内外许多研究人员竞相努力的目标。近年来，本实验室与国外几家实验室同步开展了HGF真核表达的研究，已成功构建了HGF哺乳动物细胞表达体系，表达产量理想，产物具有活性。但是，真核表达蛋白质的分离纯化工作复杂，技术条件要求高，在纯化过程中蛋白质的活性易丧失，这就限制了真核表达体系在获得纯品活性HGF方面的应用。与此同时，本实验室也探索了原核表达的可能性。原核表达体系具有成本低廉、操作容易、外源基因表达量大、适合大规模生产等真核表达体系无可比拟的优点，但由于原核表达体系缺乏对真核基因翻译后的剪切、拼接加工作用，因此用HGF cDNA全序列基因直接表达，不能表达有野生活性的HGF。

发明内容

本发明的目的在于将基因工程和蛋白质工程技术相结合，对HGF基因进行转录前加工、修饰，分别构建HGF重链(α链)表达体系和HGF轻链(β链)表达体系，分别表达HGF的重链蛋白和轻链蛋白，然后，利用异源蛋白体外共复性技术，制备有野生活性的HGF蛋白。这条技术路线不仅从实践上为大量制备肝细胞生长因子的方法提供了一种科学可行的途径，而且在理论上进一步发展了蛋白质工程技术，并将其应用理论推向一个新高度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术路线和步骤进行：

一、技术路线(图1)：

1.hHGFα、hHGFβ基因的获取；

2.pBV220-hHGFα、pBV220-hHGFβ重组质粒的构建；

3.hHGFα、hHGFβ重组质粒分别转化到不同的大肠杆菌内；

4.hHGFα和hHGFβ蛋白质的表达和分离纯化；

5.异源蛋白体外共复性和活性测定。

二、步骤：

1.hHGFα和hHGFβ原核表达体系的构建：

1).HGF基因结构分析：