[发明专利]基于四氮唑化合物的诊断

说明书

本发明是1999年3月30日申请的共同待审的美国申请序号09/282083的继续申请，该共同待审的申请是美国申请序号为09/161876(申请日1998年9月28日)的继续申请，是现在的美国专利US5902731。

本发明涉及允许在含血红蛋白的生物流体中测量分析物浓度的诊断组合物。该组合物基于四氮唑染料前体并涉及抑制血红蛋白诱导的它们的还原。

脂肪组织是人体中能量贮存最丰富的形式之一。它释放贮存的脂肪酸进入主要由肝代谢的循环系统。在该过程中，脂肪被消耗，能量被释放，被人体加以利用。通常，消耗很少的脂肪，脂肪酸完全代谢为二氧化碳和水，该转化不会打乱身体的敏感的pH平衡。然而，如果身体中的碳水化合物的量不充足，例如由于饮食，那么脂肪消耗和脂肪酸的产生可增加至潜在危害的水平。除了饮食外，依赖胰岛素的病人由于它们的碳水化合物的代谢不足而易受到伤害。当使用过量的脂肪酸以提供身体的能量需求时，会产生大量的乙酰乙酸盐、丙酮和β-羟丁酸盐。这些中间产物称为酮体，疾病是已知的酮酸中毒。

酮体通常由身体再循环为其它形式，只要它不是令人无法忍受的。因此，健康的人积聚了可忽略量的这些分析物。当大量的脂肪在相对短的时间被代谢或当大部分的能量来自脂肪时，产生大量的酮体。如果不立刻校正的话，这些脂肪代谢物的过量产生导致一定的神经性紊乱。

酮体存在于血中，并且如果超过阈值，则通过尿排泄。通过先进的临床分析仪器可容易地检测它们。β-羟丁酸盐、乙酰乙酸盐和丙酮的百分率分别平均为78％、20％和2％。由于其相对低的浓度和高挥发性，所以丙酮很少被检测到。但是，通过硝普盐反应可定量确定乙酰乙酸盐，用酶法定量β-羟丁酸盐。利用乙酰乙酸盐试验条已经数十年。它们基于硝普盐离子和醛以及酮的偶合反应。让碱性尿样或血清样品和硝普盐反应几分钟，形成紫色。颜色的强度表明乙酰乙酸盐浓度。但是，丙酮干扰该试验，导致较高的读数。另外，当病人从酮酸中毒恢复时，尿中和血中的乙酰乙酸盐含量增加，因此使诊断困难。

β-羟丁酸盐试验对于控制酮体浓度更有用。它基于β-羟丁酸盐和相应的脱氢酶在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)辅因子存在下的氧化反应。(严格地说，仅D-β-羟丁酸盐天然存在和被氧化，但为了简洁，在整个说明书和所附的权利要求书中，我们省略了“D”。)氧化时，产生NADH，用UV分光光度计直接测量其浓度。因此，在光谱中相应的信号改变和分析物的浓度成比例。不幸的是，在UV区域中发生NADH激发；因此该检测方式仅适合于实验室仪器。另一个控制β-羟丁酸盐的方法是用四氮唑化合物氧化NADH。

四氮唑化合物一般对强碱和光很敏感。因此，需特别注意保证这些化合物的完整性。然而，四氮唑化合物在研究组织代谢中起着重要的作用。例如，该类化合物已用于探测细胞中不需氧氧化和还原反应。另外，它们一般用于临床诊断。该类化合物典型地是在还原剂存在下进行还原反应以得到高度着色的甲的浅颜色或无色化合物。还原剂例如抗坏血酸盐、巯基化合物或NADH、NADPH、PQQH₂(还原的PQQ-吡咯并喹啉醌)、FMNH₂(还原的FMN-黄素单核苷酸)和EADH₂(还原的FAD-黄素腺嘌呤二核苷酸)的变体能够形成染料。

在临床诊断中，已发现这些染料在厌氧反应中对监测由它们的母化合物NAD(P)+形成NAD(P)H是非常有价值的。(参见，例如US5360595,1994年11月1日授予D.Bell等人。)氧化还原反应很快，对氧不敏感。得到的染料颜色很强烈，具有低的水溶性。

一般来说，可使用四氮唑染料前体测量全血中的酮体和葡萄糖。但是，如果血红蛋白不含在血的红细胞中，则可通过血红蛋白(Fe(Ⅱ))非酶还原四氮唑形成有色的甲。因此，游离的血红蛋白会严重干扰检测。事实上，由于溶血和产生相对于目的分析物大量的游离血红蛋白，因此，在典型的酮体测量中，来自血红蛋白的干扰信号会超过目的信号。相反，葡萄糖的测量，特别是在正常浓度或超过正常浓度时，则不受影响。当在高血细胞比容样品中或在较高温度下进行该反应时，血红蛋白氧化反应较快，同样严重干扰葡萄糖的测量。既然不易避免造成游离血红蛋白存在的红细胞的溶血，所以，如果用四氮唑分析，则必须在试验前从样品中除去红细胞。