[发明专利]一种乙型肝炎DNA疫苗

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，是具有治疗作用的乙型肝炎DNA疫苗。

乙型肝炎病毒(HBV)对人类健康的危害极大，目前全球约有慢性HBV感染者3.5亿。以重组乙型肝炎表面抗原作为疫苗的使用，已能有效预防HBV感染，但对于众多已受感染的的慢性患者，目前尚缺乏有确切疗效的药物。DNA疫苗也称为基因疫苗或核酸疫苗，是表达微生物抗原的真核重组表达质粒，一些动物和人体的实验表明DNA疫苗能诱生强的细胞免疫应答，故乙型肝炎DNA疫苗的研制已成为国内外微生物与免疫学领域的一个研究热点。

HBV的结构蛋白基因包括包膜蛋白基因preS1、preS2、HBsAg和核心蛋白基因HBc，目前报道与此相应的乙型肝炎DNA疫苗主要有四种，包含的基因分别为HBsAg、preS1-preS2-HBsAg、preS2-HBsAg或HBc，但均仅表达包膜蛋白和核心蛋白中的一种，因而不能诱导全面的抗乙肝病毒免疫应答。包含HBsAg的DNA疫苗接种小鼠、黑猩猩均能诱生抗体和细胞免疫应答，美国PowerJect疫苗公司报道用这种DNA疫苗接种健康成年人能诱生低水平的抗体以及T细胞免疫应答。包含preS1-preS2-HBsAg的DNA疫苗诱生免疫应答的效率比包含HBsAg的DNA疫苗差。包含preS2-HBsAg的DNA疫苗经小动物实验表明其免疫效果与包含HBsAg的DNA疫苗相似。包含HBc的DNA疫苗也仅能在小动物身上才较好地诱生免疫应答。

对慢性HBV感染者来说，由于其体内持续产生HBV抗原，机体免疫系统对于HBV抗原已经形成免疫耐受状态，因而接种DNA疫苗所产生的HBV抗原的免疫反应性大大低于正常人，故上述乙型肝炎DNA疫苗对于逆转慢性乙型肝炎患者的免疫耐受状态和激活HBV抗原特异性T细胞免疫应答的效果不可能理想。对感染HBV的黑猩猩接种包含HBsAg的DNA疫苗的研究也证明了这一点。

本发明的目的是提供一种免疫效力强、对慢性乙型肝炎患者具有治疗作用的DNA疫苗。

上述的乙型肝炎DNA疫苗有一个共同不足，即仅表达包膜蛋白和核心蛋白中的一种抗原，若将其联合就能有效增强细胞免疫应答强度。细胞因子白介素-12(IL-12)在诱导HBV抗原特异性细胞免疫应答中起关键作用，所以加上IL-12基因能进一步促进细胞免疫应答的诱导。一些能与人白细胞抗原HLA II抗原结合的辅助性T淋巴细胞表位能极大促进疫苗的免疫原性。鉴于此，我们将HBV包膜蛋白基因、核心蛋白基因和人IL-12基因共同构建DNA疫苗，并对乙型肝炎病毒包膜-核心蛋白抗原基因进行修饰，即在其5’末端引入了一段编码人免疫球蛋白IgG kappa链信号肽和通用型辅助性T细胞表位PADRE基因ST的核苷酸序列ATGGGAATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTTTCTGCTCCTCCTGTGGGTGCCCGGGTCCAGAGGAGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTGGATCC，以进一步激活慢性乙型肝炎患者体内对HBV包膜蛋白和核心蛋白表现为低反应性的T淋巴细胞。

本发明构建的乙型肝炎DNA疫苗含有信号肽基因和通用型辅助性T淋巴细胞表位基因ST、HBV包膜蛋白基因preS1-preS2-HBsAg(简称为S1S2S)、HBV核心蛋白基因HBc和人IL-12基因hIL-12。该DNA疫苗的转录调控结构包括人巨细胞病毒早期启动子和增强子PCMV、一段合成的内含子intron、内部核糖体进入位点序列IVS-IRES和猴病毒SV40的转录终止信号基因序列SV40 polyA。

附图说明：

图1为本发明乙型肝炎DNA疫苗的结构示意图。

图2为本实验室构建的编码HBV包膜蛋白和核心蛋白的重组质粒pUC-S1S2S和pUC-HBc的结构示意图。

图3为编码人免疫球蛋白IgG kappa链信号序列和通用型辅助性T细胞表位的DNA片段ST的制备流程图。

图4为重组质粒pcDNA-ST的构建流程图。

图5为重组质粒pcDNA-ST-HBc的构建流程图。

图6为重组质粒pcDNA-ST-S1S2S-HBc的构建流程图。

图7为重组质粒pCI-hIL12的构建流程图。

图8为重组质粒pCI-IRES-hIL12的构建流程图。

图9为重组质粒pCI-ST-HBV-hIL12的构建流程图。

本发明采用重叠延伸PCR、PCR、酶切、连接等分子生物学实验方法构建DNA疫苗，可参考美国萨姆布鲁克著《分子克隆》第二版。