[发明专利]乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体及其组建方法和应用

说明书

本发明属病毒基因工程领域，具体涉及一种乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体及其组建方法和应用。

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，具有独特的基因结构及生物学特性。该病毒的基因组是双链环状DNA，但却有一段单链区。HBV的基因组约为3200硷基对(bp)长，但其正链和负链的长短不同。负链具有固定的长度，即约3200bp。HBV的基因组有4个编码区，包膜基因(S/pre-S)，核心基因(C/pre-C)，多聚酶基因(P)及X基因。P基因最长，覆盖约80％的基因组并与其他的编码区重叠。虽然与其他的编码区有重叠，但P基因有自己的读码框架。乙型肝炎病毒引起疾病的临床表现多种多样，可为无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎，并可发展为肝硬化或肝癌。目前对HBV引起疾病的多样化认为既与机体的免疫应答相关，也可能与病毒的基因组结构与功能相关。病毒的复制是最关键的因素之一，因为如病毒停止复制则疾病的发展可受到控制。

Summers等(Cell 1982；29：403-415)首先在鸭乙肝病毒中证明病毒的复制需经过RNA复制中间体环节。以后在人乙肝病毒也证实了这一独特的复制方式。因此学者们认为HBV的复制周期与逆转录RNA病毒很相似，有些区是高度保守区，并与逆转录病毒的依赖RNA的RNA多聚酶、依赖DNA的DNA多聚酶及RNaseH相似(Toh et al，Nature1983；305：827)。通过与人类免疫缺陷病毒(HIV)及其他病毒的逆转录酶比较，目前认为乙肝病毒的多聚酶可分为4个区：自5’-末端开始，依次为末端蛋白区(TP)-连接臂区(spacer)-逆转录酶/DNA多聚酶区区(RT/DNAP)-RNA酶H区(RNAse H)(Bartenschlager andSchaller，1988；EMBO J7：4185；Radziwill et al.1990；J Virol64：613)。其中3个具有功能，认为连接臂区无重要功能。有关多聚酶功能的变异，最受关注的是与耐抗HBV药物拉米夫定的氨基酸变异，即位于P基因中间部位逆转录酶(RT)的第551-554位YMDD(氨基酸Tyrosine-Methionine-Aspartic acid-Aspartic acid，酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸)变为YVDD的变异。最近出现的对另一种药物(famciclovir)耐药的变异位于P区IP及RT区。对于HBV多聚酶的功能区，目前均已报道的与人类免疫缺陷病毒(HIV)的RT相应对比而分为A(421-436)，B(506-528)，C(546-556)，D(576-5890，E区(592-60)。上述的YMDD耐药性变异已确定在多聚酶基因的C区。

-有关HBV聚合酶基因变异与毒株复制功能相关的研究，首先Blum等报道自一例乙型肝炎患者肝组织中获得复制缺陷的HBV株，经克隆不同片段再拼接后获得全分析基因组(HBV5-15株，已在GenBank注册)。进一步用点突变及截短基因技术，发现因该毒株在P基因的TP区第2798位核苷酸由C(胞嘧啶)突变为A(腺嘌呤)导致氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸后，病毒可失去复制能力。据此，他们以这一核苷酸及相应氨基酸的改变为对象，设计了与TP区中第2598-2998核苷酸互补的寡聚核苷酸作为可发展为抑制乙肝病毒复制的一种方法(Blum et al，Virology 1984；139：87-96；Blum et al，Hepatology1991；14：56-63；USA patent5,610,050,1997)。随后不同学者分别在不同乙肝的患者或发生肝癌的患者中用基因组，基因片段测序或点突变技术研究了乙肝病毒基因组的不同部位发生突变及与复制特性的改变，但均未能发现P基因中其他有意义与复制特性相关的改变。

迄今，对HBV RT功能区的推导或设计针对HBV RT的药物，均以HIV的RT作为标准；各种病毒的类似酶除有共性外，还可具有独特的功能区。因此寻找HBV的多聚酶中新的功能区具有特殊的医药价值。

本发明的目的是用置换病毒多聚酶(P)基因及其片段组建重组嵌合体，另一目的是寻找多聚酶中的新功能区，本发明的进一步目的是设计相应抑制乙肝病毒复制的药物或诊断制品。