[发明专利]α－半乳糖苷酶缺陷的治疗

说明书

                       发明领域

本发明涉及用于治疗α-半乳糖苷酶A缺陷的方法和组合物。

                       发明背景

Fabry病(费勃莱氏病，酰基鞘氨醇己三糖苷酶缺乏症)是X染色体连锁的遗传性溶酶体贮积病，特征为严重的肾损伤、血管角质瘤、和心血管异常(包括心室膨大和二尖瓣闭锁不全)。Fabry病还影响外周神经系统，引起极度痛苦的发作，四肢灼痛。Fabry病是由α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)的缺陷引起的。α-Gal A是溶酶体糖水解酶，切割各种复合糖的末端α-半乳糖基部分。Fabry病导致阻断中性糖神经鞘脂--酰基鞘氨醇己三糖苷(CTH)的分解代谢，并在细胞内和血流中积累这种酶底物。

由于这种疾病具有X染色体连锁的遗传模式，大多数Fabry病患者是男性。虽然已经观察到受到严重影响的女性杂合子，但是女性杂合子通常没有症状，或者具有相对较弱的症状(诸如特征性角膜混浊)。剩余α-Gal A活性低、抑或有很微弱的症状抑或表面上没有Fabry病其它特征性症状的非典型性变异型Fabry病，与左心室肥大和心脏病有关Nakano等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med)333：288-293，(1995)。α-Gal A的降低可能是这些心脏异常的病因。

已经分离得到了编码人α-Gal A的cDNA和基因并进行了测序。人α-Gal A是作为429个氨基酸的多肽表达的，其N末端31个氨基酸为信号肽。人的这种酶已经在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中(Desnick等人，美国专利5,356,804；Ioannou等人，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)119：1137，(1992))和昆虫细胞中(Calhoun等人，WO 90/11353)得到表达。

然而，目前的α-Gal A制剂的功效有限。高纯度α-Gal A的制备方法依赖于使用的亲和层析法，即植物凝血素亲和层析法(伴刀豆球蛋白A(ConA)Sepharose)和基于将α-Gal A与Sepharose基质偶联的底物类似物N-6-氨基己酰基-α-D-半乳糖基胺的结合的亲和层析法的联合。参阅例如，Bishop等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)256.1307-1316，1981)。使用蛋白质性质的植物凝血素亲和树脂和底物类似物树脂通常与亲和剂从固相支持物连续脱落有关(Marikar等人，分析生化(Anal.Biochem.)201：306-310，1992)，导致纯化产物中污染了在溶液中游离的或结合了洗脱蛋白质的亲和剂。这些污染使产物不适合用于制药学制剂。结合的底物类似物和植物凝血素也可能对蛋白质的酶学、功能性、和结构特性具有实质性的消极影响。此外，用以前的方法制备的α-Gal A在肝脏中被快速清除。

因此，本领域仍然需要使用传统层析树脂的纯化方案，这种树脂可以从供应商处容易地获得，质量适用于大剂量商业用途，而且产生的α-Gal A制剂，不含亲和剂。另外，本领域仍然需要循环半衰期延长、在肝脏以外的特定组织中的摄取增加的α-Gal A制剂。

                        发明概述

本发明提供了高纯度的α-Gal A制剂及用于纯化α-Gal A糖形式的多种方法。本发明还提供了电荷改变的α-Gal A制剂及其制备方法。电荷变化是通过增加α-Gal A的唾液酸含量和/或增加α-Gal A的磷酸化来实现的。本发明还提供了在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的α-Gal A制剂及其制备方法。最后，本发明还提供了对受治疗者施用α-Gal A制剂的方法和剂量。本发明的α-Gal A可用于治疗Fabry病患者或Fabry病非典型性变异型患者(如主要为心血管异常的特定Fabry病患者群，诸如心室膨大，如左心室肥大(LVH)，和/或二尖瓣闭锁不全；或者主要为肾累及的患者)。

                       图的简述

图1表示用于从人成纤维细胞cDNA文库分离α-Gal A cDNA的210bp探针(SEQ ID NO：1)。探针的序列来自α-Gal A基因的外显子7。该探针是通过聚合酶链反应(PCR)由人基因组DNA分离的。图中标有下划线的区域对应于扩增引物的序列。