[发明专利]维生素B6的同型酶法测定和H2S检测的改进

说明书

相关申请

本申请是1999年6月28日提交的美国系列号09/340,991的部分继续申请，其内容在此引入作为参考。同时要求了1999年2月1日提交的临时申请系列号60/118,031的优先权。

技术领域

本发明涉及其活性形式是吡哆醛5’-磷酸盐的维生素B6的测定，以及采用荧光对H₂S检测的改进。更具体地说，本发明涉及采用同型半胱氨酸酶的脱辅基酶在生物液体中确定磷酸吡哆醛浓度的试剂盒和方法。同时还涉及提高通过检测由H₂S与二烷基亚苯基二胺和一种氧化剂反应产生的复合体的荧光的这些测定以及用于同型半胱氨酸测定的敏感性。

背景技术

PCT公开的WO99/05311描述了在生物样品中采用同型半胱氨酸酶进行的高度特异性同型半胱氨酸测定，该酶足以在生物液体水平上对同型半胱氨酸较半胱氨酸具有高度特异性。这使得对这些酶从半胱氨酸和同型半胱氨酸中产生的共同产物，H₂S，的检测成为对生物液体中同型半胱氨酸本身的有效测定。产生的H₂S可以通过该申请中描述的多种方法进行检测。现在已经发现此测定的敏感性可以通过检测复合体的荧光来提高，该复合体是由带比色剂的硫化氢和N，N-二烷基对亚苯基二胺和一种氧化剂如铁氰化钾形成的。生成物3，7-(双-二烷氨基)酚噻嗪-5氯化物，可以通过吸光度或激发并测定荧光来检测。

这种荧光的检测也可用于在此描述的吡哆醛5’-磷酸的测定。

吡哆醛5’-磷酸盐(PLP)是维生素B6的生物活性形式。PLP是参与氨基酸代谢和脂肪酸代谢的许多基本酶的辅因子，包括蛋氨酸酶和同型半胱氨酸酶。其他以PLP为修饰基团的酶包括糖原磷酸化酶以及所有转氨酶。PLP还参与氨基酸α-碳原子上的脱羧作用、脱氨基作用、消旋作用、氨基转移作用和醛醇裂解作用。这些酶依赖PLP是为了活化，因此PLP是一个重要的代谢因子。PLP来源于维生素B6；维生素B6不能被大多数哺乳动物，包括人类合成。因此，这种维生素一般地大多数从饮食中提供。流行病学研究显示，PLP缺乏是心血管疾病死亡率的最强的营养相关因素。维生素B6缺乏引起诸如皮炎和神经异常等症状。

由于PLP参与了代谢且其缺乏涉及多种疾病状态，在本领域中已知有多种方法可确定维生素B6水平和B6的状态。

采用carlsbergensis酵母(S.uvarum)、屎链球菌和干酪乳杆菌的微生物学测定已经被用来检测血和尿中多种形式的B6。在转变为氰化物复合体，或用荧光团，如还原后的甲基邻氨基苯甲酸缩合后，也可用荧光测定尿4’-吡哆酸和血PLP。4’-吡哆酸也可通过HPLC确定。血浆中PLP的浓度也可以通过确定用酪氨酸脱羧酶的脱辅基酶形式从标记的酪氨酸中形成的放射活性标记的酪胺来检测。血浆中的参考范围是5到30ng/ml(Reynolds，R.D.Fed.Proc.(Abst.No.2185)(1983)42：665)。这种检测的形式也可以American Laboratory ProductsCompany，Ltd.(Windham，New Hampshire 03087)的“ALPCO”试剂盒商购得到。

血转氨酶已被用作维生素B6状态的指示剂。在B6缺乏时，血清中的酶活性是被抑制的。但这些酶的释放反映了细胞的死亡，而且在许多组织中的降解导致了变异。天冬氨酸和丙氨酸转氨酶的红细胞水平可为维生素B6状态提供较好的指示(Briggs，M.主编.人类生物学和医学中的维生素(Vitamins in Human Biology and Medicine)，Boca Raton，FL，CRC Press，Inc.1981)。

在口服(2-5g)L-色氨酸后，检测尿色氨酸代谢物，如黄尿酸，也被用于指示B6状态。黄尿酸盐量在正常水平(25mg/d)之上表明维生素B6缺乏。也可应用蛋氨酸负荷试验(Briggs，M.，前面引用的书，Brown，M.L.，主编.现代营养学知识(Present Knowledge in Nutrition)，第6版.Washington，D.C.，International Life Sciences Institute-Nutrition Foundation，1990)。在B6缺乏病人负荷3g蛋氨酸后，其24小时尿中通过氨基酸分析检测的胱硫醚对亚磺酸半胱氨酸的比例是升高的。