[发明专利]氯化筒箭毒碱调节区、核苷酸序列测定及其使用的方法

说明书

本申请要求保护US临时申请60/146,540(1999.7.30提交)的利益，该申请的全部内容均引入这里作为参考。

本发明涉及控制基因表达的调节区。具体说，本发明涉及5’调节区的核苷酸序列及其片段，该片段可启动氯化筒箭毒碱基因的转录，这里称为氯化筒箭毒碱基因启动子。具体说，本发明涉及5’调节区及其片段，该片段可启动鼠的氯化筒箭毒碱基因的转录。本发明还涉及使用这种区来调节异源基因在细胞或动物中表达、改造宿主细胞、筛选出激活或抑制其转录和表达的化合物的方法，以及抑制其在细胞中表达以便促进家畜、家禽、鱼和陪伴动物肌肉生长、以及治疗肌肉萎缩和神经肌肉疾病的方法。

生长和分化因子-8(GDF-8或氯化筒箭毒碱)，这里称为氯化筒箭毒碱，属于分泌型生长和分化因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一个成员(McPherron等，Nature 387:83(1997))。TGF-β家族成员以大的前体蛋白而合成，其中所说的前体蛋白在C-末端的大约110-140氨基酸的碱性残基簇处被蛋白酶切割。C-末端区因二硫键合的二聚物而具活性，具有一些程度的氨基酸序列和结构相似性。TGF-β家族的特征在于具有一个共有氨基酸序列和在链内二硫键中的保守半胱氨酸残基，该链内二硫键造成胱氨酸结蛋白折叠。该家族的成员包括米勒抑制物质(MIS)(Behringer等，1990,Nature,345:167)；骨形态发生蛋白(BMPs)(Sampath等，1990,J.Biol.Chem.265:13198)；生长和分化因子(GDFs)；抑制素类；以及果蝇decapentaplegic蛋白(DPP-C)(Padgett等，1987,Nature 325:81)。

氯化筒箭毒碱在所有经检查的脊椎动物中得到鉴定，包括在小鼠、大鼠、人、狒狒、牛、猪、绵羊、鸡、火鸡、猫、狗和鱼中。小鼠中氯化筒箭毒碱基因的破坏会导致骨骼肌肉群大大增加，从而肌肉增生肥大，并且是引起小鼠纯合Cmpt(致密)突变的肌过大表型的至少部分原因(Mcpherron等，(1997)；Szabo,G等，哺乳类基因组(Mammalian Genome)9:671(1998))。在牛的双倍肌物种如Belgian Blue或Piedmontese中，据示牛氯化筒箭毒碱基因部分缺失或含有错义突变。(Grobet,L等，Nat.Genet.17:71(1997)；Kambadur等，Genome Res.7:910(1997)；McPherron和Lee,Proc.Natl.Acad.Sci USA 94:12457(1997))。因此，看得出氯化筒箭毒碱可起骨骼肌生长的负调节剂作用，然而没有描述调节其表达的机理(McPherron等，(1997))。

已测定了各个物种的用于氯化筒箭毒碱的cDNA序列，并且推断的氨基酸序列极其保守，特别是C-末端的109个氨基酸的氨基酸序列。WO94/21681(Lee和McPherron(1994))中公开了人和鼠氯化筒箭毒碱基因的全长氨基酸编码区的核苷酸序列。WO98/33887(Lee和McPherron(1998))中公开了大鼠和鸡氯化筒箭毒碱基因的全长氨基酸编码区的核苷酸序列。尽管人和鼠氯化筒箭毒碱基因的编码序列已被测定，但控制这些基因表达的调节序列仍未被表征。

本发明涉及氯化筒箭毒碱基因的转录调节区。具体说，本发明涉及紧靠鼠氯化筒箭毒碱编码序列5’的2.5kb多核苷酸序列，其核苷酸序列和使用该调节区的方法，以及其片段。本发明涉及本发明氯化筒箭毒碱启动子的用途，用于指导靶基因以细胞或组织特异性方式如在肌肉细胞或组织中表达。本发明涉及本发明氯化筒箭毒碱启动子在高产量筛选中用于鉴定抑制氯化筒箭毒碱启动子活性或氯化筒箭毒碱表达的试验化合物。本发明涉及增加家畜、家禽或鱼类肌肉量和饲料转化率的方法，具体说是改造瘦肉增加的动物，以便减少动物可以去被屠宰所需要的时间。根据本发明，由于治疗疾病的方法涉及氯化筒箭毒碱基因的表达，例如人和陪伴动物中与变老或生病有关的肌肉萎缩，因此可以使用氯化筒箭毒碱启动子的抑制剂来抑制氯化筒箭毒碱的表达。