[发明专利]利用家蚕生产非天然蚕丝的方法

说明书

本发明涉及蛋白质工程和DNA重组技术领域，更具体地，本发明涉及用DNA重组技术和蛋白质工程技术对蚕丝进行改造的方法、由此获得的性能改进的蚕丝、以及产生所述蚕丝的家蚕，以及生产所述蚕丝的方法。

发明背景

家蚕是一种能吐丝的经济昆虫，丝素蛋白基因可在五龄家蚕的后部丝腺中特异而高效表达，早就受到研究者的广泛注意。有关转基因家蚕的研究也受到国内外学者的重视。李振刚利用天蚕丝基因启动子与家蚕丝素蛋白启动子结构相似的特性，将完整的天蚕丝基因导入家蚕内，试图使它得到表达(李振刚，周从照，唐恒立，等.YAC介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移及其在F2代中的表达.科学通报，1995，40(24)：2267～2269)。Marshall直接地提出将外源基因置于丝素蛋白启动子的调控下，利用家蚕丝腺做为表达外源基因的生物反应器(Marshall，A.Nature Biotechnology，1998，16：530-533)。

蜘蛛丝质地轻、富有弹性、强度高，具有广泛应用前景。例如，可用作光学显微镜上的指示针、外科手术缝合线和制作降落伞、防弹衣等；可作为保护层包裹在航天器表面以防流星或陨石的碰撞。长期以来，各国科学家对蜘蛛丝的研究一直很有兴趣，试图大量获取和利用蜘蛛丝。

以园蛛属蜘蛛为例，它有7种不同的丝腺分泌丝，其中以大囊状腺分泌的拖牵丝性能最优。其独特的强度和弹性的结合使得它的断裂能远高于其他的天然纤维和人工纤维。1960年，Warwicker利用X-ray研究N.madagascarensis的拖牵丝时发现结晶区由反平行的皱褶状的β-折叠组成，晶体与无规区相比是占多数的(Warwicker J O..J MolBiol，1960，2：350)。Lewis等最先根据拖牵丝部分水解获取的短肽序列设计寡核苷酸探针筛选大囊状腺(major ampullate gland)cDNA文库获得成功(Xu M，Lewis R V..Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87(18)：7120～7124)。在最近的几篇综述(Hinman MB，JonesJA，Lewis RV.Trends Biotechnol.2000，18(9)：374-379；Hayashi CY，Lewis RV.Science，287：1477-1479.；Gosline JM，Guerette PA Ortlepp CS，et al.The Journal of ExperimentalBiology，1999，202(23)：3295-3303)详细地叙述了多种蜘蛛丝蛋白的研究进展，并且对它们的蛋白质一级结构进行了比较和分析，有一些肽序列多次出现，被认为是蜘蛛丝蛋白的基本单元，即GPGXX，GGX，聚丙氨酸，GPX和间隔区(spacer)。

有关拖牵丝结构的研究中，最有说服力的是Simmons等的研究，他们的研究表明，90％的Ala在折叠结构中，而70％的Gly在无定型区内。使用固相²H-NMR研究未定向、定向和压缩状态的纤维。结果表明拖牵丝纤维的结晶区中有两类丙氨酸富集区，一类是高度定向的；而另一类是定向较差的，并且也不是紧密堆积的(Simmons AH，Michal CA，Jelinski LW.，Science，1996，271：84-87.)。总之，现在关于蜘蛛丝强度及弹性的认识是：强度来自于结晶区，在一级结构上讲是“聚丙氨酸”这样的序列；而弹性与β-转角是相关的，而在一级结构上讲是GPGXX这样的序列。

有关拖牵丝的表达工作已在大肠杆菌和酵母中进行。由于拖牵丝基因中含有大量的重复序列，PCR克隆有困难，研究者们多倾向于采用人工合成、逐步加倍的方式获得基因。在人工合成时还兼顾了表达宿主的密码子偏好性。另外，由于大囊状腺蛋白中究竟有几种蛋白及它们之间的比例如何仍未知，所以研究者倾向于同时表达已知的两种蛋白，并将这两种蛋白按一定的比例进行组合。在对表达的产物研究中，多采用了固定金属亲和层析的方法纯化蛋白。对蛋白产物的鉴定中也多集中于Western检测、氨基酸组成分析和N-端测序的方法，也有人采用了MS的方法。对于产物二级结构的分析则仅限于CD分析。在表达研究中遇到的困难，特别突出的是表达蛋白的成纤维化问题(Prince JT，McGrath KP，DiGrolano CM，etal.，Biochemistry，1995，10879-10885；Fahnestock SR，Bedzyk LA.，Appl Microbiol Biotechnol，1997，47，33-39)。