[发明专利]具有α－半乳糖苷酶活性的多肽及其编码核酸

说明书

本发明涉及一种具有α-半乳糖苷酶活性的新的多肽以及编码该多肽的分离的核酸序列。本发明也涉及包含该核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞以及制备该多肽的方法。本发明进一步涉及该多肽在B→O血型转换中的用途。本发明还涉及一种B→O血型转换方法。

ABO血型是临床意义最为重要的血型系统，输血时如果血型不符会引起急性溶血从而导致死亡。一般来说，O型血是通用型血，可以输给任何血型的病人。如果能将其它血型的血液转变为O型，无疑可以充分利用血液资源，减少输血事故，简化输血程序，缩短等待时间，对危急情况下的输血急救意义更为重大。

人类A、B、O血型是由红细胞表面作为抗原的糖链决定的，这些结构相应地称为A、B、H抗原。B抗原与H抗原相比，内部核心完全相同，差别仅在于前者的最末端多出的一个α-半乳糖残基。在α-半乳糖苷酶活性的作用下，将B型红细胞最末端的α-半乳糖残基水解去除，就可以把B抗原改造成H抗原，从而将B型血转变为O型通用血(Yatziv et al，1971，Biochem.Biophys.Res.Commun，45，514-518)。

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC 3.2.1.22)是广泛存在于人、动物、植物、真菌以及原核生物体内的一类外切糖苷水解酶(Corcheteet al，1987，Phytochemistry，26，927-932)，可高度特异性地水解去除各种多糖底物末端的α-半乳糖残基，在生命代谢活动中具有重要作用。

早在六、七十年代，人们就发现α-半乳糖苷酶具有水解血型抗原物质的活性，并认识到利用该酶的这一特性可以实现对人类血型的体外改造。

迄今，围绕不同物种来源、特别是植物来源的α-半乳糖苷酶进行了大量研究，但由于生化性质不同，并非所有的α-半乳糖苷酶都适用于B→O血型转变。其中，咖啡豆α-半乳糖苷酶被认为是最佳选择(Harpaz等人，1975，Arch.Biochem.Biophys，170，676-683)。有文献报道，不同种类咖啡豆中存在多种形式的α-半乳糖苷酶的同工酶(Courtois等人，1966，Methods in Enzymol，8，565-571)。

美国专利4330619(1982年5月18日)和4427777(1984年1月24日)公开了利用从绿色Santos咖啡豆中提取的α-半乳糖苷酶将人红细胞B型抗原转变为H型抗原的方法，从而证明此类酶具有B→O血型转变的功能，但上述文献未能提供可靠的、足以实用化的方法。另外，从咖啡豆等植物中提取的α-半乳糖苷酶含有丹宁、色素等成分，对α-半乳糖苷酶活性有抑制作用，更加限制了它的实际应用(Goldsteinet al，1965，Phytochemistry，4，185-192)。

美国纽约血液中心Goldstein等利用上述Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶进行B→O血型转变研究，并于1996年经美国FDA批准开展人体临床实验，但距离实际应用尚有差距，主要原因在于，Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶的比活性较低，约为30U/mg，酶解转变1ml B型红细胞需要180-200U的酶，一个单位红细胞则需约1-2g，用量大、花费高，难以实用化(Lenny，1991，Blood，77，1383-1388)。另外，天然来源的α-半乳糖苷酶数量极其有限，从50磅Santos咖啡豆中提取的酶量仅能满足一次血型转变实验的需要。因此，在临床中迫切需要有一种比活性较高、较易制备的α-半乳糖苷酶活性多肽。

本发明的一个目的在于提供一种具有较高α-半乳糖苷酶活性的多肽。本发明的另一个目的在于提供编码所述多肽的多核苷酸。本发明又一目的在于提供含有所述多核苷酸的核酸构建体，含有该核酸构建体的表达载体和宿主细胞。本发明的目的还在于提供该多肽的制备方法、用途，以及一种B→O血型转换方法。

本发明涉及一种具有α-半乳糖苷酶活性的分离的多肽，其特征在于所述多肽具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，该多肽的α-半乳糖苷酶活性至少比具有SEQ ID NO：3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性更高。

本发明还涉及编码所述多肽的分离的多核苷酸，和包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及制备和应用所述多肽的方法。