本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法,该克隆猪的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列,其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1‑2所示;制备获得对应gRNA序列的CRISPR‑Cas9打靶载体PX330‑pAPN2和PX330‑pAPN3;(2)将获得的打靶载体PX330‑pAPN2或打靶载体PX330‑pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中,获得pAPN基因编辑细胞系;(3)对pAPN基因编辑细胞系进行体细胞核移植操作,并将重构胚胎移植入代孕受体,通过自然妊娠出生所述克隆猪。本发明可获得猪冠状病毒受体pAPN完全缺失表达的克隆猪,具有抵抗猪冠状病毒感染的能力。