本发明涉及分子生物学技术领域,具体涉及鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。本发明通过对铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的基因组序列进行分析,提供了用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对,其序列如SEQ ID NO.1‑2所示。在此基础上,建立了利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。该方法具有较高的灵敏度、特异性和准确性,能够高效检出铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌,具有操作简单、成本低、快速、高通量等优点,可用于临床检测、农业生产、食品安全等领域的假单胞菌的鉴别。