本发明涉及一种重组人尿激酶原的纯化方法,更具体地说是用色谱技术纯化制备重组人尿激酶原的方法。为了解决动物细胞表达的尿激酶原的大规模纯化问题,本发明公开了一种用Streamline-SP扩张床色谱、Sephacryl S-200凝胶色谱、对氨基苯甲脒Sepharose Fast Flow亲和色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱法,从哺乳动物工程细胞培养液回收基因工程产品的方法。还可以在步骤C和D之间包括步骤E:用阳离子交换Streamline-SP固定床色谱柱浓缩尿激酶原。采用上述方法得到符合SFDA要求的重组人尿激酶原,总回收率在70%以上,纯度达到99%以上。