[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法无效
| 申请号： | 201910814598.0 | 申请日： | 2019-08-30 |
| 公开（公告）号： | CN110541002A | 公开（公告）日： | 2019-12-06 |
| 发明（设计）人： | 崔佳;吴长新;赵仲华;温炟;王玉环 | 申请（专利权）人： | 山西大学;长治医学院 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027 |
| 代理公司： | 14115 太原申立德知识产权代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 程园园<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 030006*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法。具体包括以下步骤：确定asap1b基因敲除的靶点位置即asap1b‑gRNA‑Cas9靶位点，体外转录获得asap1b‑gRNA，将asap1b‑gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼受精卵中，筛选培养获得稳定遗传的asap1b基因敲除突变体。本发明根据选择的一段位于asap1b基因第1个外显子的高效率打靶序列，利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼中的asap1b基因并产生可稳定遗传的asap1b基因敲除斑马鱼，且本发明共获得了3种突变类型的asap1b基因敲除斑马鱼品系，均对Asap1b蛋白翻译造成了提前终止，对研究asap1b基因的功能奠定动物模型基础。 | ||
| 搜索关键词： | 基因敲除 斑马鱼 稳定遗传 突变体 基因 斑马鱼受精卵 斑马鱼品系 靶点位置 打靶序列 蛋白翻译 动物模型 技术构建 筛选培养 体外转录 突变类型 靶位点 高效率 外显子 敲除 研究 | ||
【主权项】：
1.一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1.设计斑马鱼asap1b基因的gRNA-Cas9打靶位点，并确认asap1b-gRNA-Cas9靶位点敲除特异性；/nS2.制备asap1b-gRNA；/nS3.将asap1b-gRNA和Cas9mRNA共同导入斑马鱼胚胎中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA-Cas9靶位点序列突变效率；/nS4.检测嵌合型F0代斑马鱼子代遗传基因类型，筛选出可以生殖遗传敲除asap1b的F0代亲本；/nS5.筛选F1代斑马鱼中asap1b基因敲除杂合突变体，确认asap1b杂合敲除突变类型；/nS6.筛选F2代斑马鱼中asap1b基因敲除纯合突变体，确认asap1b纯合敲除突变类型，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1b基因敲除突变体，即完成利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1b基因敲除突变体的构建。/n
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