[发明专利]一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途在审
| 申请号： | 201910289370.4 | 申请日： | 2019-04-11 |
| 公开（公告）号： | CN109867718A | 公开（公告）日： | 2019-06-11 |
| 发明（设计）人： | 王斌 | 申请（专利权）人： | 南京鼓楼医院 |
| 主分类号： | C07K14/48 | 分类号： | C07K14/48;C07K1/14;C12N5/0797;A61K38/18;A61P25/28 |
| 代理公司： | 南京钟山专利代理有限公司 32252 | 代理人： | 戴朝荣 |
| 地址： | 210008 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | 本发明提供一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途，人神经干细胞由人胚胎干细胞系诱导分化而成，选择第2‑3代处于对数生长期的人神经干细胞，收集干细胞培养基，进行高浓度的复合再生因子的制备。本发明人制备的神经干细胞来源的再生因子在治疗脊髓损伤中具有很好的应用前景，为有效治疗中枢神经系统损伤，包括创伤性脑损伤，脊髓损伤等提供新选择。 | ||
| 搜索关键词： | 再生因子 制备 神经干细胞 人神经干细胞 复合 中枢神经系统损伤 人胚胎干细胞系 创伤性脑损伤 干细胞培养基 治疗脊髓损伤 对数生长期 脊髓损伤 有效治疗 诱导分化 应用 | ||
【主权项】：
1.一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A：将胚胎干细胞在10CM细菌培养皿中以无血清培养基悬浮培养7‑10天形成熟拟胚体，然后将成熟拟胚体打散、贴壁培养于一号Neurobasal培养基中，诱导其向神经干细胞定向分化，形成神经干细胞，然后将诱导而成的神经干细胞置于二号Neurobasal培养基中，选择处于2‑3代对数生长期的神经干细胞收集培养基；步骤B：吸出二号Neurobasal培养基，将神经干细胞置于DMEM/F12培养基中继续培养12小时，然后将细胞和培养基转移至离心管进行离心处理，收集离心管中的上清，备用；步骤C：将收集的上清分装到离心管，每管15mL，然后将各离心管冷冻干燥，离心管里形成固体粉末；步骤D：取每管冷冻干燥的粉末，采用1.5mL去离子水重新溶解，使用PD‑10预装脱盐柱进行脱盐纯化，得到高蛋白浓度的洗脱液；步骤E：重新收集洗脱液于离心管中，每管20mL，冷冻干燥成粉末，然后再用2mL去离子水重新溶解，得到高浓度的复合再生因子。
下载完整专利技术内容需要扣除积分，VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于南京鼓楼医院，未经南京鼓楼医院许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/patent/201910289370.4/，转载请声明来源钻瓜专利网。
- 上一篇：一种血浆中α1微球蛋白的提取方法
- 下一篇：一种尿促性素中间品的提纯方法
- 同类专利
- 睫状神经营养因子受体配体结合剂及其使用方法-201780084930.1
- 金准宇;詹妮弗·R·科克伦;埃里克·亚历杭德罗·斯威特 - 小利兰·斯坦福大学理事会
- 2017-12-06 - 2019-09-13 - C07K14/48
- 提供了特异性结合睫状神经营养因子受体(CNTFR)配体的药剂。在某些方面，本公开的药剂是可溶性CNTFR多肽。可溶性CNTFR多肽可以对一种或多种配体‑CNTFR复合物亚基具有改变的(例如，降低的)结合亲和力，对一种或多种CNTFR配体具有改变的(例如，增加的)结合亲和力，或其任何组合。还提供了包含本公开的药剂的组合物，以及使用所述药剂的方法(例如，用于治疗细胞增殖性病症)和鉴定个体具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性病症的方法。
- 一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途-201910289370.4
- 王斌 - 南京鼓楼医院
- 2019-04-11 - 2019-06-11 - C07K14/48
- 本发明提供一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途，人神经干细胞由人胚胎干细胞系诱导分化而成，选择第2‑3代处于对数生长期的人神经干细胞，收集干细胞培养基，进行高浓度的复合再生因子的制备。本发明人制备的神经干细胞来源的再生因子在治疗脊髓损伤中具有很好的应用前景，为有效治疗中枢神经系统损伤，包括创伤性脑损伤，脊髓损伤等提供新选择。
- 一种重组神经生长因子的震荡纯化器-201910177775.9
- 不公告发明人 - 充烜金
- 2018-04-02 - 2019-05-31 - C07K14/48
- 本发明涉及医疗用具技术领域，更具体的说是一种重组神经生长因子的震荡纯化器，装置通过控制震荡驱动机构，可以实现对纯化管中的提取液进行上下震荡，旋转控制机构可以带动震荡驱动机构和旋转驱动件内的纯化管进行圆环形运动，这样纯化管的环形晃动和上下震荡起到的颠簸作用可以施加到纯化管中进行形成震荡纯化作用；装置取代了人工用手摇晃纯化管，避免出现震荡效果不佳的现象发生,极大的减轻了医务人员的工作难度。所述的支架的下端滑动连接在底座上，驱动轴转动连接在支架上，驱动轴的下端与底座连接，震荡驱动机构滑动连接在底座上，旋转驱动件固定连接在震荡驱动机构的上端，震荡驱动机构和旋转驱动件均连接在驱动轴上。
- 一种神经生长因子的提取方法-201811342937.1
- 张世贤;马磊;张增伟 - 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司
- 2018-11-09 - 2019-05-17 - C07K14/48
- 本发明公开了一种神经生长因子的提取方法，包括将含有神经生长因子的上清液酸化离心得到酸解上清液，将所述酸解上清液进行阳离子交换层析，收集含有神经生长因子的目的洗脱峰，得到蛋白液1；将蛋白液1进行疏水层析，收集含有神经生长因子的目的洗脱峰，得到目标蛋白液；其中，该方法不包括阳离子反吸附层析步骤。与现有技术相比，本发明的方法步骤简单，更安全可靠，得到的神经生长因子样品的纯度、收率和样品活性均有提高。本发明不仅适用于鼠神经生长因子的提取，也可适用于人神经生长因子的提取，为神经生长因子的大规模分离纯化提供了新的途径。
- 一种重组神经生长因子的震荡纯化器-201810284397.X
- 陈彬;姜有维 - 陈彬
- 2018-04-02 - 2019-05-17 - C07K14/48
- 本发明涉及医疗用具技术领域，更具体的说是一种重组神经生长因子的震荡纯化器，装置通过控制震荡驱动机构，可以实现对纯化管中的提取液进行上下震荡，旋转控制机构可以带动震荡驱动机构和旋转驱动件内的纯化管进行圆环形运动，这样纯化管的环形晃动和上下震荡起到的颠簸作用可以施加到纯化管中进行形成震荡纯化作用；装置取代了人工用手摇晃纯化管，避免出现震荡效果不佳的现象发生,极大的减轻了医务人员的工作难度。所述的支架的下端滑动连接在底座上，驱动轴转动连接在支架上，驱动轴的下端与底座连接，震荡驱动机构滑动连接在底座上，旋转驱动件固定连接在震荡驱动机构的上端，震荡驱动机构和旋转驱动件均连接在驱动轴上。
- 多肽及结合多肽的抗体-201810989455.9
- 蔡秀梅;戴茹萍;王华茂 - 上海易乐生物技术有限公司
- 2018-08-28 - 2019-03-05 - C07K14/48
- 本发明涉及特异性结合脑源性神经营养因子前体蛋白pro‑BDNF的抗体及其结合表位。本发明还涉及使用所述抗体和蛋白治疗自身免疫性疾病的组合物和方法，所述病症可通过抑制pro‑BDNF介导的活性来治疗，诸类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘或囊性纤维化、多发性硬化和其它自身免疫性和炎性病症。
- 新型proNGF突变体及其在生产β-NGF中的用途-201711352074.1
- S·洛里;B·简诺瓦斯基;H·帕特克;D·卡特曼;A·帕蒂尔;A·安东 - 瓦克化学有限公司
- 2012-12-19 - 2019-03-01 - C07K14/48
- 本发明涉及proNGF突变体及其用途，具体而言是proNGF突变体用于生产人β‑NGF的用途。本发明公开了由无活性的不可溶的proNGF突变体制备生物活性的人β‑NGF的方法。本发明的proNGF突变体在天然蛋白酶切割位点R1SK3R4处的至少位置R1和K3中被除了Arg或Lys以外的任何氨基酸取代，其中所述的位置R1和K3对应于所述的人野生型proNGF序列的位置101和103。
- 长效神经生长因子、制备方法及其组合物-201710270229.0
- 张晴爽 - 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司
- 2017-04-24 - 2018-11-02 - C07K14/48
- 本发明提供了一种长效神经生长因子，其包含第一个多肽，该多肽具有N末端和与具有N末端和C末端的第二个多肽融合的C末端，其特征在于：第一个多肽是神经生长因子，并且第一个多肽的C末端与第二个多肽的N末端融合后得到的长效神经生长因子，所述长效神经生长因子具有超过14小时的体内半衰期，且生物活性较高。
- 一种清除rhNGF中N端截短及异常变异体的方法-201810253680.6
- 刘文超;孙洪亮;张怡 - 江苏中新医药有限公司
- 2018-03-26 - 2018-08-31 - C07K14/48
- 一种清除rhNGF中N端截短及异常变异体的方法，使用阳离子交换层析进行，特别是采用了阶段电导升高的方法进行。实验证实，经过本发明方法的纯化，纯化产物中的N端截短及异常变异体含量大幅降低。
- 疏水层析动态清除重组人神经生长因子前体的方法-201810253682.5
- 刘文超;孙洪亮;张怡 - 江苏中新医药有限公司
- 2018-03-26 - 2018-08-31 - C07K14/48
- 一种使用疏水作用层析清除重组人神经生长因子中前体的方法，其特征是，在洗脱前增加清洗步骤，使用阶段电导及有机溶剂降低的清洗液进行清洗，使前体分子变异体的清除得以实现。
- 一种人源突变型神经生长因子及其制备方法和应用-201810027039.0
- 武成彪;杨宛霖;肖健;吴艳青;李校堃 - 温州医科大学;温州市生物医药协同创新中心
- 2018-01-11 - 2018-07-24 - C07K14/48
- 本发明公开了一种人源突变型神经生长因子，其是在野生型proNGF多肽链第221个氨基酸位置上的色氨酸代替了精氨酸（proNGFR221W），导致成熟的NGF多肽链第100个氨基酸位置上的色氨酸代替了精氨酸(成熟NGFR100W)所形成。hNGFR100可以支持周围神经系统的感觉神经元和交感神经元，同时也可以调节中枢神经系统和周围神经系统部分神经元的营养状态，但其不会像其野生型NGFWT引起疼痛反应，从而解决长期困扰和阻碍NGF在临床上运用的关键问题，可用于预防或治疗各种外周性与中枢性神经性以及免疫疾病。
- 一种高纯度rhNGF的制备方法-201810253683.X
- 刘文超;孙洪亮;张怡 - 江苏中新医药有限公司
- 2018-03-26 - 2018-07-03 - C07K14/48
- 一种从CHO细胞培养物中得到高纯度rhNGF的方法。结合了阳离子交换层析和疏水作用层析方法，其特征是，在两种方法层析前，分别进行增加了清洗步骤。实验证实，经过本发明方法的纯化，不仅能够清除rhNGF前体分子变异体，而且纯化产物中的N端截短及异常变异体含量大幅降低，产品纯度高，能满足临床使用要求。
- 一种野生型rhNGF的制备方法-201410024634.0
- 张文宇;章永垒;陈星;白羊;黄奋飞;陈胜亮;阮卡 - 未名生物医药有限公司
- 2014-01-20 - 2017-03-29 - C07K14/48
- 本发明公开了一种野生型β‑hNGF的制备方法，步骤为hNGF片段获取；酶切后与载体连接，诱导表达，亲和层析纯化；Factor Xa或肠激酶或Genenase I切除MBP标签蛋白，获得野生型β‑hNGF。此方法能够产业化方法，纯化得率高，纯度高。
- 一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法-201610882905.5
- 张文宇;黄奋飞;章永垒;白羊;陈星;陈胜亮;阮卡;葛平辉;邹有土;马燕玲;王明灶 - 未名生物医药有限公司
- 2016-10-10 - 2017-03-08 - C07K14/48
- 本发明公开了一种从哺乳动物细胞培养物中分离重组人神经生长因子的方法。步骤为，强阳离子交换层析将澄清后的哺乳动物细胞培养物上清加样到强阳离子交换层析树脂上，并使用洗脱缓冲液进行洗脱得到第一重组人神经生长因子；疏水层析将第一重组人神经生长因子处理后加样到疏水作用层析树脂上，并使用洗脱缓冲液洗脱得到第二重组人神经生长因子即可。所述方法操作步骤更少，缩短了生产周期、提高了回收率，纯度高，均一性好，体外生物活性极高，通常大于1.5×105 U/mg，远高于市场中注射用鼠神经生长因子（0.5×105 U/mg）。
- 一种神经生长因子的提取方法-201510313567.9
- 张增伟;张世贤 - 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司
- 2015-06-09 - 2017-01-04 - C07K14/48
- 本发明提供了一种神经生长因子的提取方法，所述方法包括：将小鼠颌下腺组织匀浆后离心收集匀浆上清液；对所述匀浆上清液进行CM反吸附阳离子交换层析后收集流穿液；对所述流穿液进行酸化离心后收集酸解上清液；对所述酸解上清液进行吸附阳离子交换层析收集目标蛋白峰对应的目的蛋白液；对所述目的蛋白液进行疏水层析，获得疏水层析后的目的蛋白液。本发明的工艺简化了工艺步骤，流程简单，不仅大大缩短了制备所用的时间，同时提高了产品的均一性与活性，并且样品纯度也得到了进一步的提高，为NGF的分离纯化提供了新的途径。
- 眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法-201610268411.8
- 张学荣;侯瑞雪;张可星;罗小玲;廖明;班建东;孙林;蔡凤桃;陈缨;农君;李洪涛 - 广西医科大学
- 2016-04-27 - 2016-07-06 - C07K14/48
- 本发明公开了一种眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，先采用DEAE CL‑6B阴离子交换柱然后再利用Sephadex G‑50凝胶层析柱、Macro‑prep High S阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后采用PC12细胞检验法用超纯水对所收集的各峰稀释后进行检验选取蛇毒神经生长因子活性最高的峰作为下步分离的样品。其中，通过稀释测定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度，发明人找到了蛇毒分离过程中NGF的最高活性峰，并确定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度达到0.1μg/ml。试验表明，应用本发明可得到电泳纯的NGF，其纯度高、活性高。
- 一种rhNGF成熟肽的制备方法-201410024115.4
- 张文宇;章永垒;陈星;黄奋飞;白羊;阮卡;陈胜亮 - 厦门北大之路生物工程有限公司
- 2014-01-20 - 2014-06-25 - C07K14/48
- 本发明公开了一种rhNGF成熟肽的制备方法。步骤为表达载体及工程菌的构建；包涵体表达，收集菌体；包涵体裂解、洗涤、溶解、复性，得到pro-rhNGF复性液；阳离子交换层析初步纯化pro-rhNGF复性液；疏水作用层析二次纯化pro-rhNGF；胰蛋白酶酶切去除pro-rhNGF前导肽获得rhNGF成熟肽；rhNGF成熟肽的第三次纯化得到纯化的rhNGF成熟肽。本发明的方法可进行产业化生产rhNGF成熟肽，纯度高，得率高。
- 具有低免疫副作用的神经生长因子突变体的制备方法及其药物应用价值-201110427988.6
- 江涛;唐捷;童琼;周洪哲;孙含丽 - 中国科学院生物物理研究所
- 2011-12-19 - 2013-06-19 - C07K14/48
- 本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及鼠源神经生长因子(mNGF)与脂类小分子lysoPS复合物的晶体结构以及复合物的细胞生物学效应。通过晶体结构分析确定了mNGF结合lysoPS的关键氨基酸，即，第88位赖氨酸，随后利用定点突变技术突变该位点，制备突变体蛋白并开展细胞实验。研究结果表明，mNGF突变体蛋白结合lysoPS的能力明显下降，其对细胞的毒副作用也明显降低。本发明提供上述复合物的晶体结构，脂类小分子lysoPS的结构特点，mNGF突变体蛋白的制备方法以及其在调控免疫系统和神经系统药物方面的用途。
- 减低蛇毒神经生长因子免疫毒性使之成为鼠源神经生长因子的药物替代品的方法-201110428037.0
- 江涛;唐捷;童琼;周洪哲;孙含丽 - 中国科学院生物物理研究所
- 2011-12-19 - 2013-06-19 - C07K14/48
- 本发明通过结构生物学和生物化学研究发现来自眼镜蛇的神经生长因子(cNGF)特异结合脂类小分子，是其免疫毒性的主要来源之一。因此，本发明涉及眼镜蛇毒神经生长因子(cNGF)的纯化方法和脱脂方法，利用有机溶剂采取特殊工艺对纯化的cNGF进行处理，成功地去除了脂类小分子，并通过细胞实验证实脱脂后的cNGF减少了对小鼠肥大细胞瘤细胞的免疫毒性，可作为鼠源神经生长因子的替代药物作为低副作用具有神经营养作用的药物。
- 一种聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法-201210469251.5
- 任宏伟;林昳;陈星;陈胜亮 - 厦门北大之路生物工程有限公司
- 2012-11-19 - 2013-03-13 - C07K14/48
- 本发明涉及一种聚乙二醇-神经生长因子的制备方法，具体包括：结合：将神经生长因子与聚乙二醇溶解在pH为4－10的缓冲溶液中，两者物质的量比例为1:10，室温下搅拌24小时；纯化并回收，得到聚乙二醇同神经生长因子结合物；还包括浓缩回收的蛋白质。还包括按照所述方法制备得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物，及含聚乙二醇同神经生长因子结合物的组合物。还保护聚乙二醇同神经生长因子结合物在制备医药上的用途。该方法简单易行，将神经生长因子与聚乙二醇相结合后，仍然保持了神经生长因子的活性，且可以提高神经生长因子在体内半衰期，减少给药频率，减少病患痛苦。
- 一种人神经生长因子的重组变异体及其制备方法-201110223536.6
- 王革 - 王革
- 2011-08-05 - 2013-02-06 - C07K14/48
- 本发明公开了一种人神经生长因子的重组变异体rhNGF及其制备方法。我们根据分子结构研究设计的人神经生长因子重组变异体(rhNGF)其肽段N端少了SSSHPIFHRG 10个氨基酸，多了GA二个氨基酸，此后从EFSV开始的序列同于人神经生长因子正常序列。采用全基因合成的方法获得rhNGF的cDNA，构建工程菌进行表达，得到rhNGF融合蛋白，用羟胺切割后进行纯化即得到纯化的rhNGF，其具有天然生物活性。
- 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途-201110213670.8
- 陈薇;侯利华;宋小红;于婷;付玲;于蕊;房婷 - 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
- 2011-07-28 - 2013-01-30 - C07K14/48
- 本发明公开了一种重组人神经生长因子缺失突变体，所述突变体是完整人神经生长因子肽链C端缺失3个氨基酸；所述突变体氨基酸序列为：如序列表SEQ ID No.1所示。或所述突变体的氨基酸序列为与SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列具有95％以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。本发明所述的突变体采取表达C末端缺失3个氨基酸rhNGF(rhNGF-D3)的策略来保持rhNGF的C末端完整性，并且通过此改造，相比较于rhNGF，在真核细胞中rhNGF-D3蛋白表达水平提高5～10倍，生物活性保持不变，蛋白C端均一。
- 基于CHO细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法-201210206171.0
- 史权威;乐伟;霍立红;李曼;刘荷中 - 北京华安科创生物技术有限公司
- 2012-06-18 - 2012-10-03 - C07K14/48
- 本发明涉及“基于CHO细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法”，包括如下步骤：1）将上清先后离心去除活细胞、细胞碎片，过滤去除杂质和细菌；2）上清上样于
EMD SO3-（M）层析柱，冲洗未结合蛋白以及杂质蛋白，洗脱，收集目的蛋白峰；用截留分子量为3K的超滤设备浓缩蛋白，4）上样于含Superdex 75层析柱，收集目的蛋白峰，即为重组人神经生长因子原液。本发明的表达系统和方法可以制备纯度大于98％，比活性高于5×105AU/mg的重组人神经生长因子。本发明与其他方法相比减少了操作步骤，大大缩短了生产周期，提高了处理量和得率，适合规模化生产。
- 一种神经生长因子-紫杉醇偶联物及其制法和用途-201110367988.1
- 徐希明;黄治民;刘宏飞;闫真芳;余江南;曹霞 - 江苏大学
- 2012-02-07 - 2012-06-27 - C07K14/48
- 一种神经生长因子-紫杉醇偶联物，它是以神经生长因子为载体，通过丁二酸与紫杉醇偶联的神经生长因子-紫杉醇偶联物，该偶联物是一个神经生长因子上连接有1-6个紫杉醇分子的神经生长因子-紫杉醇偶联物。本发明的神经生长因子-紫杉醇偶联物为白色固体，与紫杉醇原料药相比，其溶解度提高约20～50倍。由于神经生长因子的存在，使得其具有靶向的作用，可以降低对正常细胞的损伤，有效的保护患者的生命安全，也提高了紫杉醇的应用。与紫杉醇原料药相比，相同浓度条件下，其体外抑制肿瘤细胞的能力要强于紫杉醇原料药。
- 一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的纯化方法-201010011464.4
- 吕宪峰;刘志强;王东;林峰;曹恒;张坤 - 中鑫东泰(莱阳)纳米基因生物技术有限公司
- 2010-01-15 - 2010-09-29 - C07K14/48
- 本发明公开了一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的纯化方法，是将冻干的眼镜蛇蛇毒溶解后用硫酸铵溶液进行沉淀，然后离心取上清液，采用截留分子量为3K的超滤膜膜包超滤，交换缓冲液至pH 5.0浓度为50mM的NaAc缓冲溶液，交换完缓冲液的样品上样于CM Sepharose FF柱层析，收集目的蛋白，上样于Superdex 75柱，收集目的蛋白，得到眼镜蛇蛇毒神经生长因子原液，本发明与现有技术方法相比提高了处理量和得率，适用于规模化生产。
- 专利分类
