[发明专利]一种具有细胞粘附功能的可发光胶原多肽-镧系金属复合纳米材料的制备方法

摘要

本发明公开一种具有细胞粘附功能的可发光胶原多肽‑镧系金属复合纳米材料的制备方法。其包括(1)胶原多肽的设计；(2)胶原多肽的合成；(3)胶原多肽‑镧系金属复合纳米材料的制备；(4)复合纳米材料的发光性质；(5)复合纳米材料的细胞粘附功能。本发明采用的胶原多肽在广泛的pH条件下，均可在镧系金属离子的介导下，自组装形成和天然胶原蛋白具有类似微观结构的纳米纤维材料。该复合纤维材料，不仅具有优异的发光性质，而且表现出良好的细胞粘附功能，为仿生天然胶原的结构和功能提供了新的策略，在组织工程和再生医用中有巨大的发展潜力。

主权项

1.一种具有细胞粘附功能的可发光胶原多肽‑镧系金属复合纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)胶原多肽的设计设计氨基酸序列的胶原多肽，包括:设计富含(Gly‑Pro‑Hyp)n或(Gly‑Pro‑Pro)n序列，使得多肽形成三重螺旋结构；设计包含天然胶原蛋白中调控细胞粘附功能的序列；设计多肽两端以及多肽中间的1‑3个位置的氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸，使得该位置的天冬氨酸或谷氨酸与镧系金属精确配位；(2)胶原多肽的合成将步骤(1)设计好的胶原多肽采用Fmoc固相合成法，利用手动合成仪逐步合成，合成步骤为：a、树脂处理溶胀；b、活化氨基酸；c、缩合反应；d、α‑氨基脱保护；e、延伸肽树脂；f、切割肽树脂；g、肽的分离纯化；(3)胶原多肽‑镧系金属复合纳米材料的制备配制浓度为1‑100mg/mL的胶原多肽溶液、浓度为1‑100mg/mL的不同镧系金属的硝酸盐溶液，将其混合后，在25℃的恒温箱里放置反应1‑48hrs，将得到的反应产物在8000rpm下进行固液分离，得到固体沉淀；(4)复合纳米材料的发光性质将上述步骤(3)得到的固体沉淀放入25℃的恒温培养箱烘干24‑96hrs，得到干燥的胶原多肽‑镧系金属复合纳米材料；利用荧光光谱仪检测该固体样品的激发波长和发射波长；(5)复合纳米材料的细胞粘附功能将上述步骤(3)得到的固体沉淀分散于无水乙醇中，得到固含量为1‑10mg/mL的悬浮溶液，将悬浮溶液滴至96微孔板中，使其完全干燥，用PBS洗涤三次，加入100μL无血清DMEM或MEM培养基的细胞悬液，在37℃孵育3‑6小时，用PBS或是生理盐水轻轻洗涤96微孔板2‑3次，将96微孔板中加入超纯水冷冻‑融化循环三次，进行裂解细胞；然后加入工作浓度为5μg/mL Hoechst33258染料避光培养1h，最后用酶标仪测定荧光强度。