[发明专利]一种PM2.5细菌群落组成来源快速分析及风险评估方法

摘要

本发明公开了一种PM2.5细菌群落组成来源快速分析及风险评估方法，属于微生物分析技术领域，该方法主要包括城市功能区PM2.5的取样、微生物基因组DNA提取、对提取好的DNA产物进行PCR扩增、PCR产物纯化、荧光定量，高通量测序并进行细菌多样性及丰度分析，以及风险预测。相对于传统培养法，该方法更加细致全貌的反映了研究样品的菌群结构，不仅实现了快速、准确的分析颗粒物样品的细菌多样性，同时是评价城市空气环境质量及预测疾病风险的有效方法。总之，本发明具有覆盖面广、检测准确度及灵敏度高，预测结果更加科学可靠等优点。

主权项

1.一种PM2.5细菌群落组成来源快速分析及风险评估方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)PM2.5样品采集：先将采样用具进行消毒灭菌处理，在空气采样器的采样口设置灭菌处理后的石英滤膜，在距离地面10‑12m高度处进行采样，待采样完成后将负载有PM2.5样品的样品膜，于‑20℃下保存；(2)样品DNA提取：使用灭菌处理的剪刀、镊子在超净台将所述样品膜剪成均匀碎片，利用无菌牙刷签刮取样品膜上的样品，再利用剪刀将所述样品进行剪碎处理，并分成四步加入到研磨珠套管中进行振荡，在65℃水浴处理10min后，提取样品中的DNA，再用NanoDrop2000超微量蛋白质核酸分析仪测定所述的DNA浓度和纯度后，置于‑20℃中保存；(3)PCR扩增及产物纯化：将步骤(2)中提取的DNA使用16S V4区引物进行一次PCR扩增，得到一次PCR产物，对所述一次PCR产物进行一次纯化处理，得到一次纯化产物；以所述一次纯化产物为模板连接Index和接头，进行二次PCR扩增，得到二次PCR产物，再对所述二次PCR产物进行二次纯化处理，得到二次纯化产物；(4)荧光定量和高通量测序：使用Qubit对所述二次纯化产物进行荧光定量检测，然后使用TruSeq在建库试剂盒进行文库构建，使用Agilent Bioanalyzer 2100系统评估测序文库质量，最后在Illumina HiSeq 2500平台上进行高通量测序；得到有效序列，并校正有效序列方向；(5)数据分析：从每个样本数据中选取75,000条序列，将每条reads截取240bp，并去除嵌合体，然后选取OTU并与Greengene数据库比对，去除其中的古菌序列，获得序列信息；得出PM2.5细菌群落组成结构，并分析菌群多样性、各类PM2.5细菌的相对丰度及优势细菌类群丰度，进一步研究分析PM2.5来源环境；(6)风险预测：采用Logistic回归法建立方程模型，根据步骤(5)中所述各类PM2.5细菌的相对丰度计算出PM2.5细菌群落的致病系数，再根据疾病的一般传播规律对未知样本进行疾病的风险预测，并得出预测结果；所述方程模型如下所示：F(t)＝A[PNs(t)Δt‑μNh(t)Δt]    (3)s(t)+h(t)＝1   (4)h(t)＝(1‑P)Δt      (5)其中，P为PM2.5细菌群落的致病系数；xi为各PM2.5细菌的相对丰度；βi为Logistic回归模型参数；αi为各细菌种群突变系数；Δmi为各细菌种群的突变数量；Δni为各细菌分裂的世代数；F(t)为疾病的风险预测评分值；A为风险修正系数；N为监测区域的总人数；s(t)为某一时刻监测区域内的健康人数比例；h(t)为某一时刻监测区域内因PM2.5细菌群落的致病人数比例；μ为因PM2.5细菌群落的致病人群的日治愈率。