[发明专利]一种PM2.5细菌群落组成来源快速分析及风险评估方法

权利要求书

1.一种PM2.5细菌群落组成来源快速分析及风险评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)PM2.5样品采集：先将采样用具进行消毒灭菌处理，在空气采样器的采样口设置灭菌处理后的石英滤膜，在距离地面10-12m高度处进行采样，待采样完成后将负载有PM2.5样品的样品膜，于-20℃下保存；

(2)样品DNA提取：使用灭菌处理的剪刀、镊子在超净台将所述样品膜剪成均匀碎片，利用无菌牙刷签刮取样品膜上的样品，再利用剪刀将所述样品进行剪碎处理，并分成四步加入到研磨珠套管中进行振荡，在65℃水浴处理10min后，提取样品中的DNA，再用NanoDrop2000超微量蛋白质核酸分析仪测定所述的DNA浓度和纯度后，置于-20℃中保存；

(3)PCR扩增及产物纯化：将步骤(2)中提取的DNA使用16S V4区引物进行一次PCR扩增，得到一次PCR产物，对所述一次PCR产物进行一次纯化处理，得到一次纯化产物；以所述一次纯化产物为模板连接Index和接头，进行二次PCR扩增，得到二次PCR产物，再对所述二次PCR产物进行二次纯化处理，得到二次纯化产物；

(4)荧光定量和高通量测序：使用Qubit对所述二次纯化产物进行荧光定量检测，然后使用TruSeq在建库试剂盒进行文库构建，使用Agilent Bioanalyzer 2100系统评估测序文库质量，最后在Illumina HiSeq 2500平台上进行高通量测序；得到有效序列，并校正有效序列方向；

(5)数据分析：从每个样本数据中选取75,000条序列，将每条reads截取240bp，并去除嵌合体，然后选取OTU并与Greengene数据库比对，去除其中的古菌序列，获得序列信息；得出PM2.5细菌群落组成结构，并分析菌群多样性、各类PM2.5细菌的相对丰度及优势细菌类群丰度，进一步研究分析PM2.5来源环境；

(6)风险预测：采用Logistic回归法建立方程模型，根据步骤(5)中所述各类PM2.5细菌的相对丰度计算出PM2.5细菌群落的致病系数，再根据疾病的一般传播规律对未知样本进行疾病的风险预测，并得出预测结果；

所述方程模型如下所示：

F(t)＝A[PNs(t)Δt-μNh(t)Δt] (3)

s(t)+h(t)＝1 (4)

h(t)＝(1-P)Δt (5)

其中，P为PM2.5细菌群落的致病系数；x_i为各PM2.5细菌的相对丰度；β_i为Logistic回归模型参数；α_i为各细菌种群突变系数；Δm_i为各细菌种群的突变数量；Δn_i为各细菌分裂的世代数；F(t)为疾病的风险预测评分值；A为风险修正系数；N为监测区域的总人数；s(t)为某一时刻监测区域内的健康人数比例；h(t)为某一时刻监测区域内因PM2.5细菌群落的致病人数比例；μ为因PM2.5细菌群落的致病人群的日治愈率；

步骤(3)中所述V4区特异性引物序列正向引物：AYTGGGYDTAAAGNG，反向引物：TACNVGGGTATCTAATCC；

步骤(3)中所述V4区特异性引物序列反向引物：TACNVGGGTATCTAATCC，正向引物：AYTGGGYDTAAAGNG；

步骤(3)中所述一次PCR扩增和二次PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，退火温度55℃下反应30s，72℃延伸30s，共25个循环，最后在72℃延伸5min；

步骤(3)中所述一次纯化处理的方法为：将所述一次PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用1X AMPure XP Beads进行纯化；

步骤(3)中所述二次纯化处理的方法为：将所述二次PCR产物采用1X AMPure XP Beads去除引物二聚体小片段，采用0.7X+0.15X AMPure XP Beads纯化筛选目的片段，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测。

2.如权利要求 1所述的一种PM2.5细菌群落组成来源快速分析及风险评估方法，其特征在于，步骤(1)中所述石英滤膜的灭菌处理方式为在450℃马弗炉烘烤2h。

3.如权利要求 1所述的一种PM2.5细菌群落组成来源快速分析及风险评估方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取样品中的DNA使用的为PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒操作标准方法。