[发明专利]一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法

摘要

本发明属于食品致病菌检测技术领域，具体涉及一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，包括收集待测样品，制成样品溶液；乳制品前处理；制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片；制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片处理样品；提取金黄色葡萄球菌DNA；PCR检测。本发明针对金黄色葡萄球菌建立一种从乳品中灵敏快速实用性强无需前增菌的PCR检测方法，检测时间为4小时，且检测限低，检测灵敏度高，不容易出现假阳性或者假阴性结果，可以确保食品从农场到餐桌流通过程中的食品安全实时检测。

主权项

1.一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，收集待测样品，去脂肪，制成去脂肪样品溶液；S2，乳制品前处理将无水乙醇、氨水和石油醚分别加入到样品溶液中，混匀，得到的混合物离心，弃去上清液，将沉淀溶于10mmol/L的TE缓冲液中，得到去脂肪样品溶液；其中，无水乙醇、氨水、石油醚、样品溶液和TE缓冲液的体积比例为1：1：1：25：1；S3，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆按照1～5:1～5的质量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶剂为10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液，溶质为SDS；除菌，得到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液；制备滤纸圆片，灭菌，浸泡于无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液中，充分浸湿滤纸圆片，干燥，用超纯水清洗滤纸圆片，再次干燥，得到纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片；S4，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片处理样品向去脂肪样品溶液加入0.25倍体积的乙酸乙酯，混匀，离心，去掉上清液，沉淀用灭菌超纯水悬浮，加入所述纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片，充分浸湿，取出滤纸圆片干燥；将干燥的纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定的滤纸圆片浸入到灭菌的10g/100ml的SDS溶液中，搅拌，取出滤纸圆片并放入到10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液中，搅拌，用无菌去离子水清洗滤纸圆片两次；清洗过后的滤纸圆片再次干燥，得到金黄色葡萄球菌吸附滤纸；S5，提取金黄色葡萄球菌DNA将金黄色葡萄球菌吸附滤纸浸泡在含有牛血清白蛋白的蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精DNA溶液和去离子水；沸水浴，得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，离心，取上清并加入等量体积4℃预冷的无水乙醇，离心，弃去上清液，保留沉淀的DNA，加入无菌去离子水溶解沉淀的DNA，得到DNA模板，备用；S6，PCR检测PCR检测使用的引物序列为：nuc1：5’‑gcagatttacgagatagaggaaca‑3’nuc2：5’‑tttatgtggttatttcctgac‑3’如果获得的PCR检测产物片段为827bp，则结果为阳性。