[发明专利]一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统及其构建方法

摘要

本发明公开了一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统及其构建方法，该系统构建方法的步骤为：1）确定了异源蛋白的插入位点；2）成功构建融合增强型绿色荧光蛋白EGFP的WhNV重组类病毒粒子VLP库；3）的构建融合人禽流感病毒H5抗原蛋白的武汉野田村重组病毒粒子库；4）武汉野田村病毒展示系统的建立；该系统包括1）武汉野田村病毒WhNV衣壳，2）作为异源蛋白插入WhNV衣壳蛋白中的融合蛋白，3）连接子linker，在融合蛋白的N端与C端分别添加小段氨基酸序列作为linker与WhNV衣壳连接。本构建方法方法易行，操作简便，通过本构建方法成功建立的WhNV异源抗原展示系统，为建立高效、稳定、高通用性的流感VLP疫苗开发平台，进而建立多种疫苗及药物开发平台奠定良好基础。

主权项

1.一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统的构建方法，其步骤是：（1）异源蛋白插入位点的确定：根据生物信息学手段分析WhNV衣壳蛋白的结构，找出其中β桶状结构和表面茎环结构Loop的位置区域，确定Loop中适合插入异源多肽和蛋白的潜在位点；（2）融合增强型绿色荧光蛋白EGFP的WhNV重组类病毒粒子VLP库的构建：对Loop区域的插入位点两端添加一小段氨基酸序列作为连接子，通过基因改造手段，构建便操作的载体，将EGFP通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入WhNV衣壳蛋白中所有Loop区域的插入位点，构建两种融合方式的WhNV重组VLP库，通过免疫荧光观察，蔗糖密度梯度离心，电镜观察方法筛选出展示构象的EGFP，病毒粒子组装的WhNV重组VLP库，利用EGFP作为报告基因，获得插入异源蛋白后不影响其结构和抗原性并能形成类病毒粒子的稳定系统；（3）融合人禽流感病毒H5抗原蛋白50‑204位氨基酸的WhNV重组VLP库的构建：在所述的步骤（2）中使用EGFP筛选出候选插入位点的基础上，结合生物信息学分析，进一步筛选插入位点，同样将人禽流感病毒H5抗原蛋白50‑204 氨基酸结构域通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入插入位点，构建融合人禽流感病毒H5抗原蛋白50‑204 氨基酸结构域的WhNV重组VLP库，运用电镜技术以及免疫反应活性实验筛选出折叠的高免疫活性的VLP；（4）WhNV展示系统的建立：结合所述的步骤（3）中的结果，通过对不同细胞系、培养基、培养条件的摸索，优化重组VLP的表达系统，对优化后的重组VLP进行免疫反应活性实验，为新型疫苗进行评测，通过所述的步骤（2）与所述的步骤（3）的筛选，进一步确定WhNV Loop上插入位点，结合优化的重组VLP表达系统，建立稳定的WhNV异源多肽和蛋白展示系统。