[发明专利]用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了用于检测肿瘤标志物miRNA‑141的SERS生物传感器的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）将Fe3O4@Au磁性纳米颗粒与捕获探针结合得到捕获单元溶液；（2）将空心金纳米球与引发探针结合制备即得信号单元溶液；（3）将捕获单元、miRNA‑141和信号单元反应结合，磁选分离得到SERS生物传感器，其应用为利用拉曼光谱仪测定SERS信号，测定一系列不同浓度的miRNA‑141对应的SERS信号强度，建立miRNA‑141浓度与SERS信号强度之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中miRNA‑141浓度，优点是灵敏度高、特异性强、组装过程简单以及检测速度快。

主权项

1.一种用于检测肿瘤标志物miRNA‑141的SERS生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）捕获单元制备a. 制备Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将0.7～1.0 g FeCl3·6H2O和0.2～0.5 g FeCl2·4H2O溶于50～100 mL水，通氮除氧，搅拌混合均匀，升温到80～100 ℃，缓慢滴加20～25wt%氨水，调节pH=9～10，继续加热搅拌1～2 h后，停止加热，在氮气保护下，搅拌回流，冷却至室温，水清洗至中性，乙醇定容至50 mL，即得Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；b. 制备氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液：将40～50 mL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1 h，加入0.2～0.3 mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4～5 h，加入1～2 mL 0.1～0.5 mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4 h，水清洗至中性，乙醇定容至100 mL，即得氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液；c. 制备Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液：将5～10 mL氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒溶液和10～20 mL 1wt% HAuCl4溶液在60～100 kHz的超声频率下混合，搅拌1 h后，缓慢加入30～50 mL 20～30 mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3 h，水清洗至中性，乙醇定容至20 mL，即得Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液；d. 制备捕获单元溶液：取50～100 µL Fe3O4@Au磁性纳米颗粒溶液超声5～10 min，加入20～50 µL 1～5 µmol/L捕获探针溶液，用DNA固定液定容至200 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h，利用Au‑S键合作用，捕获探针自组装在Fe3O4@Au磁性纳米颗粒的表面，清洗；滴加10～20 µL 10～20 mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，清洗；用缓冲液定容至100 µL，即得捕获单元溶液；（2）信号单元制备a. 制备金纳米颗粒溶液：取10～20 µL四羟甲基氯化磷加入到50～60 mL 6～7 mmol/L NaOH溶液中，搅拌5 min，加入1.8～2.0 mL 1wt% HAuCl4溶液，溶液颜色由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色，继续搅拌30 min，置于4 ℃冰箱密封避光保存，陈化2周，即得金纳米颗粒溶液；b. 制备氨基化SiO2纳米颗粒溶液：取2～3 mL正硅酸乙酯加入到40～60 mL乙醇中，再加入3～4 mL水、3～4 mL 10～20 wt%氨水和40～50 mL乙醇，混合均匀，室温下反应20 h，水清洗，乙醇定容至50 mL，得到SiO2纳米颗粒溶液；取10 mL SiO2纳米颗粒溶液，加入100～120 µL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷，混合均匀，80 ℃下烘箱中反应2 h，冷却之后，超声0.5 h，离心清洗，用水定容至10 mL，得到氨基化SiO2纳米颗粒溶液；c. 制备二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液：取100～120 µL氨基化SiO2纳米颗粒溶液，加入到50～60 mL金纳米颗粒溶液中，搅拌2 h，清洗，水定容至20 mL，即得二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液；d. 制备空心金纳米球溶液：称取10～15 mg K2CO3溶于40～50 mL水中，搅拌5 min后，逐滴加入0.8～1.0 mL 1wt% HAuCl4溶液，继续搅拌，溶液由黄色逐渐变为无色，得到K2CO3‑HAuCl4生长液；取40～50 mL K2CO3‑HAuCl4生长液，加入0.5～1.0 mL二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液，搅拌5 min，加入0.3～0.5 mL 0.1 mol/L H2O2溶液，继续搅拌30 min，溶液由粉红变紫色再变蓝色最后深红色，离心清洗，水定容至20 mL，得到金纳米壳溶液；取5～6 mL金纳米壳溶液，加入2～3 µL 0.02 mol/L氢氟酸，缓慢搅拌，离心清洗，水定容至20 mL，得到空心金纳米球溶液；e. 制备信号单元溶液：取300～400 µL空心金纳米球溶液，超声10 min，加入5～10 µL 5～10 µmol/L引发探针溶液，用DNA固定液定容至500 µL，混合均匀，37 ℃下震荡3～4 h，暗处放置24 h后，加入发卡DNA 1和发卡DNA 2，37 ℃下孵育2～3 h，进行HCR扩增，离心清洗，缓冲液定容500 µL，得到HGNs/HCR溶液；取400～500 µL的HGNs/HCR溶液，加入5～10 µL 5～10 mmol/L AgNO3溶液，反应20 min，Ag+吸附到HGNs表面和DNA双链中，加入10～20 µL 10～20 mmol/L氢醌溶液，反应30 min，吸附的Ag+被还原为银纳米颗粒，缓冲液清洗，定容至500 µL，得到AgNPs@HGNs/HCR溶液；取400～500 µL的AgNPs@HGNs/HCR溶液，加入5～10 µL 0.5～1.0 mmol/L罗丹明6G溶液，孵育2～3 h，缓冲液清洗，即得信号单元溶液；（3）SERS生物传感器制备取5～10 µL捕获单元溶液，加入5～10 µL一定浓度的miRNA‑141溶液，在37℃下孵育2 h后；加入5～10 µL信号单元溶液，并在37 ℃下孵育2 h；清洗，并用磁铁进行分离，反复三次，得到用于检测肿瘤标志物miRNA‑141的SERS生物传感器。